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Previous issue date: 2016-12-16 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The increase of antibiotic-resistant bacteria encourages the search for new antibacterial
substances. Therefore, the selection of microorganisms with potential for the production of
new antimicrobial compounds has been extensively studied. Among these microorganisms,
special attention is given to actinomycetes that are capable of producing a wide variety of
bioactive compounds, such as antibiotics, antifungals, antitumorals and other compounds that
can be applied in various segments of the industry. The genus Streptomyces is considered of
great industrial importance due to its capacity to produce many secondary metabolites,
accounting for 80% of the antibiotics currently used. In previous studies, it was possible to
report the antimicrobial activity of a strain of Streptomyces spp. Which showed inhibitory
activity against Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae ATCC
49619 and Enterococcus faecalis ATCC 292123. Subsequently, its tuberculicidal activity was
also inhibited by the growth of M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). From these
preliminary results, the present work had the objective of analyzing extracts and fractions of
metabolites of Streptomyces sp. Aiming to isolate, purify and chemically identify the
compound (s) with antimicrobial and tuberculicidal activity. The fractions in hexane (fr-Hex),
ethyl acetate (fr-AcoEt) and chloroform (fr-Clo) were obtained from the metabolites obtained
in liquid AC medium and by liquid-liquid partition using solvents of increasing polarity. The
fr-Clo was chosen to continue the tests because its yield was higher, presenting high
antibacterial activity in the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) tests against the
bacteria Staphylococcus aureus and Mycobacterium smegmatis. Thus, the fr-Clo was
subjected to thin layer chromatography (CCD) using several eluent systems and then the
Bioautography technique was performed to identify the compounds with activity. From this
purification two bioactive sub-fractions were obtained, which were subjected to the isolation
of the compounds by preparative CCD and HPLC-DAD-MS technique. The isolated
substances were named Clarin A and Clarin B, which presented a Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) of 1.0 μg / mL for Clarin A and 0.5 μg / mL for Clarin B against
Staphylococcus aureus and 16 μg / Ml against Mycobacterium smegmatis. They did not
present cytotoxicity to 3T3-L1 non-tumor cells. The Clarin A and Clarin B substances were
analyzed using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and low resolution and high resolution
Mass Spectrometry techniques for chemical identification. The isolated substances were
identified as Actinomycin D and Actinomycin X2 with m / z of 1277 [M + Na] and 1291 [M
+ Na]. The strong antibacterial activity of the isolated substances makes this product an
important source of natural antibacterial compounds. / O aumento de bactérias resistentes a antibióticos incentiva a pesquisa por novas substâncias
antibacterianas. Diante disso, a seleção de microrganismos com potencial para a produção de
novos compostos antimicrobianos tem sido amplamente estudada. Dentre estes
microrganismos uma especial atenção é dada aos actinomicetos que apresentam capacidade de
produzir uma ampla variedade de compostos bioativos como antibióticos, antifúngicos,
antitumorais entre outros compostos que podem ser aplicados nos mais diversos segmentos da
indústria. O gênero Streptomyces é considerado de grande importância industrial devido à sua
capacidade de produzir muitos metabólitos secundários, respondendo por 80% dos
antibióticos utilizados atualmente. Em trabalhos anteriores, foi possível reportar a atividade
antimicrobiana de uma linhagem de Streptomyces spp. que apresentou atividade inibitória
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 e
Enterococcus faecalis ATCC 292123. Posteriormente, verificou-se ainda a sua atividade
tuberculicida inibindo o crescimento da M. tuberculosis H37Rv (ATCC 27294). A partir
desses resultados preliminares, o presente trabalho teve por objetivo analisar os extratos e
frações de metabólitos de Streptomyces sp. visando isolar, purificar e identificar
quimicamente o(s) composto(s) com atividade antimicrobiana e tuberculicida. A partir dos
metabólitos obtidos em meio AC líquido e por partição líquido-líquido utilizando solventes de
polaridade crescente, obteve-se as frações em hexano (fr-Hex), acetato de etila (fr-AcoEt) e
clorofórmio (fr-Clo). A fr-Clo foi escolhida para dar continuidade aos ensaios pois o seu
rendimento foi maior, apresentando alta atividade antibacteriana nos testes de Concentração
Inibitória Mínima (CIM), contra as bactérias Staphylococcus aureus e Mycobacterium
smegmatis. Dessa forma, a fr-Clo foi submetida à Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
utilizando vários sistemas de eluentes e, em seguida, a técnica de Bioautografia foi realizada
para identificar os compostos com atividade. Dessa purificação foram obtidas duas subfrações
bioativas, as quais foram submetidas ao isolamento dos compostos pela técnica de
CCD preparativa e HPLC – DAD-MS. As substâncias isoladas foram denominados Clarina A
e Clarina B, as mesmas apresentaram uma Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 1,0
μg/mL para a Clarina A e 0,5 μg/mL para Clarina B frente a bactéria Staphylococcus aureus e
16 μg/mL frente a Mycobacterium smegmatis. As mesmas não apresentaram citotoxidade para
céluas não tumorais 3T3-L1. As substâncias Clarina A e Clarina B foram analisadas por meio
das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massas de baixa
e alta resolução para identificação química. As substâncias isoladas foram identificadas como
Actinomicina D e Actinomicina X2 com m/z de 1277 [M + Na] e 1291 [M+Na]. A forte
atividade antibacteriana apresentada pelas substâncias isoladas torna este produto uma
importante fonte de compostos antibacterianos naturais
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5655 |
| Date | 16 December 2016 |
| Creators | Silva, Ingrid Reis da |
| Contributors | Procópio, Rudi Emerson Lima, Veiga Junior, Valdir Florêncio da, Batista, Ieda Hortêncio, Andrade, Edmar Vaz de, Willerding, André Luis, Zanotto, Sandra Patrícia |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600, 500, 461231695918095045 |
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