Plants, more precisely their chloroplasts with their bacterial-like expression machinery inherited from their cyanobacterial ancestors, can potentially offer a cheap expression system for proteinaceous pharmaceuticals. This system would be easily scalable and provides appropriate safety due to chloroplasts maternal inheritance. In this work, it was shown that three phage lytic enzymes (Pal, Cpl-1 and PlyGBS) could be successfully expressed at very high levels and with high stability in tobacco chloroplasts. PlyGBS expression reached an amount of foreign protein accumulation (> 70% TSP) that has never been obtained before. Although the high expression levels of PlyGBS caused a pale green phenotype with retarded growth, presumably due to exhaustion of plastid protein synthesis capacity, development and seed production were not impaired under greenhouse conditions.
Since Pal and Cpl-1 showed toxic effects when expressed in E. coli, a special plastid transformation vector (pTox) was constructed to allow DNA amplification in bacteria. The construction of the pTox transformation vector allowing a recombinase-mediated deletion of an E. coli transcription block in the chloroplast, leading to an increase of foreign protein accumulation to up to 40% of TSP for Pal and 20% of TSP for Cpl-1. High dose-dependent bactericidal efficiency was shown for all three plant-derived lytic enzymes using their pathogenic target bacteria S. pyogenes and S. pneumoniae. Confirmation of specificity was obtained for the endotoxic proteins Pal and Cpl-1 by application to E. coli cultures. These results establish tobacco chloroplasts as a new cost-efficient and convenient production platform for phage lytic enzymes and address the greatest obstacle for clinical application. The present study is the first report of lysin production in a non-bacterial system. The properties of chloroplast-produced lysins described in this work, their stability, high accumulation rate and biological activity make them highly attractive candidates for future antibiotics. / Lytische Enzyme aus Bakteriophagen bieten Eigenschaften, die sie zu vielversprechenden Medikamenten im Einsatz gegen bakterielle Krankheiten machen. Obwohl sie speziell beim Einsatz gegen bakterielle Infektionen, welche durch Antibiotika resistente Erreger hervorgerufen werden, eine maßgebende Rolle spielen könnten, waren bisher die hohen Produktionskosten ein Hindernis für die medizinische Anwendung. Ein kostengünstiges und einfach zu handhabendes System, wie beispielsweise Chloroplasten in Pflanzen, würde diese lytischen Enzyme zu einer effizienten Alternative zu herkömmlichen Antibiotika machen.
In dieser Arbeit wird erstmals die erfolgreiche Produktion von lytischen Enzymen in Tabak-Chloroplasten vorgestellt, welche mit einem Fremdproteingehalt von mehr als 70% des gesamtlöslichen Proteins der Pflanze eine Menge beschreibt, die bisher mit diesem Verfahren noch nicht erreicht wurde.
Alle in Chloroplasten hergestellten lytischen Enzyme zeigten hohe spezifische bakteriolytische Aktivität gegen die gewählten Humanpathogene und waren innerhalb von Minuten in der Lage diese Bakterien abzutöten.
Zur Herstellung von zwei lytischen Enzymen wurde in dieser Arbeit ein spezieller Shuttle-Vektor entworfen, der die Expression von toxischen Genen innerhalb von E. coli Zellen im Zuge der DNA Replikation vermeidet, jedoch die Herstellung einer ungehinderten Expression der toxischen Gene in den Chloroplasten nach Beseitigung des Selektionsmarkers erlaubte.
Ein Vergleich zwischen einem herkömmlich verwendeten Transformationsvektor und dem Shuttle-Vektor mittels eines Reportergens zeigte, dass das neu entwickelte System bis zu 4 mal mehr Protein produzierte.
Diese Ergebnisse zeigen das Potential von Chloroplasten als kostengünstige und leicht zu handhabende Produktionsplattform für lytische Enzyme, welche als neue Generation von Antibiotika attraktive Alternativen zu herkömmlichen Therapien bieten.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:2895 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Oey, Melanie |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie, Extern. Extern |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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