Die weltweit steigenden Antibiotikaresistenzen sind zu einer globalen Herausforderung geworden. Von dieser Entwicklung betroffen ist auch das Bakterium Helicobacter Pylori (H.p), welches in Ländern des afrikanischen Kontinents besonders hohe Prävalenzraten aufweist. In ressourcenschwachen Ländern wie Tansania ist aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit diagnostischer Testverfahren die Identifizierung und Therapie von H.p. infizierten Personen oft unzureichend. Tansania weist im internationalen Vergleich bislang nur wenige Studien zur H.p.-Prävalenz und Antibiotikaresistenzlage auf. Um die Datenlage für Tansania zu verbessern wurden im Rahmen dieser Arbeit potentielle Risikofaktoren für sowie die Prävalenz und aktuelle Resistenzlage von H.p.-Infektionen bei Patientinnen und Patienten mit epigastrischen Beschwerden in Tansania untersucht. Darüber hinaus wurden diagnostische Schnelltestverfahren für H.p.-Infektionen im Hinblick auf ihre Testgenauigkeit und Anwendbarkeit in Tansania geprüft. Zur Identifizierung mögliche infektionsassoziierte Faktoren wurden mittels Fragebögen soziodemographische und klinische Merkmale sowie Aspekte der Lebensgewohnheiten und Lebensumstände der Probanden erhoben und statistisch ausgewertet. Die Prävalenzbestimmung des untersuchten Studienkollektivs erfolgte anhand der auf dem 23S-rDNA Gen basierten qRT-PCR, welche für diese Arbeit als Referenzverfahren definiert wurde. Die resistenzcodierenden DNA-Abschnitte wurden auf bekannte Resistenzmutationen gegen Clarithromycin- und Fluorchinolon-Antibiotika hin untersucht. Die Ergebnisse dieser Studie deuten auf eine weite Verbreitung von H.p.-Infektionen bei Patientinnen und Patienten mit epigastrischen Beschwerden in Tansania hin. Die darüber hinaus festgestellte hohe Anzahl molekulargenetisch nachgewiesener Resistenzraten von H.p.-Stämmen gegenüber Antibiotika verdeutlichen die Wichtigkeit einer sicheren Diagnostik und resistogrammgerechten Therapie im Klinikalltag. Die in dieser Arbeit untersuchten Schnelltestmethoden scheinen aufgrund der geringen Sensitivitäts- und NPW-Werte als Standardverfahren hierfür nicht geeignet. Die Etablierung einer routinemäßig durchgeführten prätherapeutischen Antibiogrammerstellung und eine daran angepasste Therapie wären wünschenswert. / Increasing antimicrobial resistance to commonly used antibiotics have become a global challenge. This development also affects the bacterium Helicobacter Pylori (H.p.), which shows high prevalence rates in African countries. The identification and therapy of H.p. infected people in resource-limited countries such as Tanzania is often insufficient due to the limited availability of diagnostic tests. By international comparison, there are only a few studies on the prevalence of antibiotic resistance rates of H.p. for Tanzania. In order to improve the data situation for Tanzania, this study investigates potential risk factors as well as the prevalence and current resistance situation of H.p. infections in Tanzanian patients with dyspeptic symptoms. In addition, rapid diagnostic test methods for H.p. infections were tested to identify their accuracy and applicability in Tanzania. Data about the patients’ sociodemographic situation, symptoms and aspects of lifestyle habits and living conditions were collected and statistically examined in order to identify possible risk factors for infection. The prevalence of H.p. is based on the results of the 23S-rDNA gene-based qRT-PCR. The resistance-encoding DNA segments: the 23S rDNA gene region and the gyrA gene were sequenced and evaluated for known resistance mutations to clarithromycin and fluoroquinolone antibiotics. The results of this study indicate that H.p. infections are widespread in patients with dyspeptic symptoms in Tanzania and that the resistance rates of H.p. strains to antibiotics are relatively high. This underlines the importance of reliable diagnostic tests and resistogram-based therapy in clinical practice. The establishment of a routine pretherapeutic antibiogram and an accordingly adapted therapy are desirable.

Plants, more precisely their chloroplasts with their bacterial-like expression machinery inherited from their cyanobacterial ancestors, can potentially offer a cheap expression system for proteinaceous pharmaceuticals. This system would be easily scalable and provides appropriate safety due to chloroplasts maternal inheritance. In this work, it was shown that three phage lytic enzymes (Pal, Cpl-1 and PlyGBS) could be successfully expressed at very high levels and with high stability in tobacco chloroplasts. PlyGBS expression reached an amount of foreign protein accumulation (> 70% TSP) that has never been obtained before. Although the high expression levels of PlyGBS caused a pale green phenotype with retarded growth, presumably due to exhaustion of plastid protein synthesis capacity, development and seed production were not impaired under greenhouse conditions. Since Pal and Cpl-1 showed toxic effects when expressed in E. coli, a special plastid transformation vector (pTox) was constructed to allow DNA amplification in bacteria. The construction of the pTox transformation vector allowing a recombinase-mediated deletion of an E. coli transcription block in the chloroplast, leading to an increase of foreign protein accumulation to up to 40% of TSP for Pal and 20% of TSP for Cpl-1. High dose-dependent bactericidal efficiency was shown for all three plant-derived lytic enzymes using their pathogenic target bacteria S. pyogenes and S. pneumoniae. Confirmation of specificity was obtained for the endotoxic proteins Pal and Cpl-1 by application to E. coli cultures. These results establish tobacco chloroplasts as a new cost-efficient and convenient production platform for phage lytic enzymes and address the greatest obstacle for clinical application. The present study is the first report of lysin production in a non-bacterial system. The properties of chloroplast-produced lysins described in this work, their stability, high accumulation rate and biological activity make them highly attractive candidates for future antibiotics. / Lytische Enzyme aus Bakteriophagen bieten Eigenschaften, die sie zu vielversprechenden Medikamenten im Einsatz gegen bakterielle Krankheiten machen. Obwohl sie speziell beim Einsatz gegen bakterielle Infektionen, welche durch Antibiotika resistente Erreger hervorgerufen werden, eine maßgebende Rolle spielen könnten, waren bisher die hohen Produktionskosten ein Hindernis für die medizinische Anwendung. Ein kostengünstiges und einfach zu handhabendes System, wie beispielsweise Chloroplasten in Pflanzen, würde diese lytischen Enzyme zu einer effizienten Alternative zu herkömmlichen Antibiotika machen. In dieser Arbeit wird erstmals die erfolgreiche Produktion von lytischen Enzymen in Tabak-Chloroplasten vorgestellt, welche mit einem Fremdproteingehalt von mehr als 70% des gesamtlöslichen Proteins der Pflanze eine Menge beschreibt, die bisher mit diesem Verfahren noch nicht erreicht wurde. Alle in Chloroplasten hergestellten lytischen Enzyme zeigten hohe spezifische bakteriolytische Aktivität gegen die gewählten Humanpathogene und waren innerhalb von Minuten in der Lage diese Bakterien abzutöten. Zur Herstellung von zwei lytischen Enzymen wurde in dieser Arbeit ein spezieller Shuttle-Vektor entworfen, der die Expression von toxischen Genen innerhalb von E. coli Zellen im Zuge der DNA Replikation vermeidet, jedoch die Herstellung einer ungehinderten Expression der toxischen Gene in den Chloroplasten nach Beseitigung des Selektionsmarkers erlaubte. Ein Vergleich zwischen einem herkömmlich verwendeten Transformationsvektor und dem Shuttle-Vektor mittels eines Reportergens zeigte, dass das neu entwickelte System bis zu 4 mal mehr Protein produzierte. Diese Ergebnisse zeigen das Potential von Chloroplasten als kostengünstige und leicht zu handhabende Produktionsplattform für lytische Enzyme, welche als neue Generation von Antibiotika attraktive Alternativen zu herkömmlichen Therapien bieten.

The life of microorganisms is characterized by two main tasks, rapid growth under conditions permitting growth and survival under stressful conditions. The environments, in which microorganisms dwell, vary in space and time. The microorganisms innovate diverse strategies to readily adapt to the regularly fluctuating environments. Phenotypic heterogeneity is one such strategy, where an isogenic population splits into subpopulations that respond differently under identical environments. Bacterial persistence is a prime example of such phenotypic heterogeneity, whereby a population survives under an antibiotic attack, by keeping a fraction of population in a drug tolerant state, the persister state. Specifically, persister cells grow more slowly than normal cells under growth conditions, but survive longer under stress conditions such as the antibiotic administrations. Bacterial persistence is identified experimentally by examining the population survival upon an antibiotic treatment and the population resuscitation in a growth medium. The underlying population dynamics is explained with a two state model for reversible phenotype switching in a cell within the population. We study this existing model with a new theoretical approach and present analytical expressions for the time scale observed in population growth and resuscitation, that can be easily used to extract underlying model parameters of bacterial persistence. In addition, we recapitulate previously known results on the evolution of such structured population under periodically fluctuating environment using our simple approximation method. Using our analysis, we determine model parameters for Staphylococcus aureus population under several antibiotics and interpret the outcome of cross-drug treatment. Next, we consider the expansion of a population exhibiting phenotype switching in a spatially structured environment consisting of two growth permitting patches separated by an antibiotic patch. The dynamic interplay of growth, death and migration of cells in different patches leads to distinct regimes in population propagation speed as a function of migration rate. We map out the region in parameter space of phenotype switching and migration rate to observe the condition under which persistence is beneficial. Furthermore, we present an extended model that allows mutation from the two phenotypic states to a resistant state. We find that the presence of persister cells may enhance the probability of resistant mutation in a population. Using this model, we explain the experimental results showing the emergence of antibiotic resistance in a Staphylococcus aureus population upon tobramycin treatment. In summary, we identify several roles of bacterial persistence, such as help in spatial expansion, development of multidrug tolerance and emergence of antibiotic resistance. Our study provides a theoretical perspective on the dynamics of bacterial persistence in different environmental conditions. These results can be utilized to design further experiments, and to develop novel strategies to eradicate persistent infections. / Das Leben von Mikroorganismen kann in zwei charakteristische Phasen unterteilt werde, schnelles Wachstum unter Wachstumsbedingungen und Überleben unter schwierigen Bedingungen. Die Bedingungen, in denen sich die Mikroorganismen aufhalten, verändern sich in Raum und Zeit. Um sich schnell an die ständig wechselnden Bedingungen anzupassen entwickeln die Mikroorganismen diverse Strategien. Phänotypische Heterogenität ist eine solche Strategie, bei der sich eine isogene Popolation in Untergruppen aufteilt, die unter identischen Bedingungen verschieden reagieren. Bakterielle Persistenz ist ein Paradebeispiel einer solchen phänotypischen Heterogenität. Hierbei überlebt eine Popolation die Behandlung mit einem Antibiotikum, indem sie einen Teil der Bevölkerung in einem, dem Antibiotikum gegenüber tolerant Zustand lässt, der sogenannte "persister Zustand". Persister-Zellen wachsen unter Wachstumsbedingungen langsamer als normale Zellen, jedoch überleben sie länger in Stress-Bedingungen, wie bei Antibiotikaapplikation. Bakterielle Persistenz wird experimentell erkannt indem man überprüft ob die Population eine Behandlung mit Antibiotika überlebt und sich in einem Wachstumsmedium reaktiviert. Die zugrunde liegende Popolationsdynamik kann mit einem Zwei-Zustands-Modell für reversibles Wechseln des Phänotyps einer Zelle in der Bevölkerung erklärt werden. Wir untersuchen das bestehende Modell mit einem neuen theoretischen Ansatz und präsentieren analytische Ausdrücke für die Zeitskalen die für das Bevölkerungswachstums und die Reaktivierung beobachtet werden. Diese können dann einfach benutzt werden um die Parameter des zugrunde liegenden bakteriellen Persistenz-Modells zu bestimmen. Darüber hinaus rekapitulieren wir bisher bekannten Ergebnisse über die Entwicklung solch strukturierter Bevölkerungen unter periodisch schwankenden Bedingungen mithilfe unseres einfachen Näherungsverfahrens. Mit unserer Analysemethode bestimmen wir Modellparameter für eine Staphylococcus aureus-Popolation unter dem Einfluss mehrerer Antibiotika und interpretieren die Ergebnisse der Behandlung mit zwei Antibiotika in Folge. Als nächstes betrachten wir die Ausbreitung einer Popolation mit Phänotypen-Wechsel in einer räumlich strukturierten Umgebung. Diese besteht aus zwei Bereichen, in denen Wachstum möglich ist und einem Bereich mit Antibiotikum der die beiden trennt. Das dynamische Zusammenspiel von Wachstum, Tod und Migration von Zellen in den verschiedenen Bereichen führt zu unterschiedlichen Regimen der Populationsausbreitungsgeschwindigkeit als Funktion der Migrationsrate. Wir bestimmen die Region im Parameterraum der Phänotyp Schalt-und Migrationsraten, in der die Bedingungen Persistenz begünstigen. Darüber hinaus präsentieren wir ein erweitertes Modell, das Mutation aus den beiden phänotypischen Zuständen zu einem resistenten Zustand erlaubt. Wir stellen fest, dass die Anwesenheit persistenter Zellen die Wahrscheinlichkeit von resistenten Mutationen in einer Population erhöht. Mit diesem Modell, erklären wir die experimentell beobachtete Entstehung von Antibiotika- Resistenz in einer Staphylococcus aureus Popolation infolge einer Tobramycin Behandlung. Wir finden also verschiedene Funktionen bakterieller Persistenz. Sie unterstützt die räumliche Ausbreitung der Bakterien, die Entwicklung von Toleranz gegenüber mehreren Medikamenten und Entwicklung von Resistenz gegenüber Antibiotika. Unsere Beschreibung liefert eine theoretische Betrachtungsweise der Dynamik bakterieller Persistenz bei verschiedenen Bedingungen. Die Resultate könnten als Grundlage neuer Experimente und der Entwicklung neuer Strategien zur Ausmerzung persistenter Infekte dienen.

Salmonella (S.) Infantis-Infektionen des Menschen, oft durch Lebensmittel übertragen, sind weltweit von wachsender Bedeutung. Daher war das Ziel dieser Arbeit ein Lysotypiesystem zur Charakterisierung von S. Infantis-Stämmen zu entwickeln. 154 Bakteriophagen wurden zwecks Evaluierung ihrer diskriminatorischen Fähigkeit für S. Infantis-Stämme getestet. Das etablierte Lysotypiesystem umfasst letztlich 17 Typisierphagen. Insgesamt wurden 1008 S. Infantis-Stämme in dieser Arbeit untersucht, die aus Ausbrüchen und sporadischen Fällen von Gastroenteritiden des Menschen, von Tieren, aus Lebensmitteln, Futtermitteln und durch Umgebungs- untersuchungen von 1973 bis 2009 isoliert wurden. Von den 1008 untersuchten S. Infantis-Stämmen waren 985 Isolate durch das etablierte Lysotypiesystem typisierbar und konnten in 61 Lysotypen (LT) unterteilt werden. 23 Stämme konnten durch die Lysotypie nicht charakterisiert werden. Unter den 61 Lysotypen dominierten vor allem die Lysotypen LT 29 (30 %), LT 1 (21 %), LT 11 (7 %) sowie LT 9 (7 %), die sowohl beim Menschen als auch in Lebensmitteln und bei Tieren vorkamen, und wahrscheinlich als epidemisch relevante Stämme anzusehen sind. Bemerkenswert ist auch der Befund, dass Stämme des LT 23 in Deutschland nur in den 70er Jahren beim Mensch gefunden wurden, was für einen Erregerwandel spricht. Zur molekularen Subdifferenzierung wurden 325 S. Infantis-Isolate verschiedener Herkunft ausgewählt und durch Lysotypie und XbaI-Makrorestriktionsanalyse untersucht, wobei 31 Lyso- und 58 XbaI-Typen identifiziert wurden. Die Analyse von Stämmen (n = 89), die zu mehreren Ausbrüchen gehörten, zeigen innerhalb eines Geschehens einen einheitlichen Lyso- bzw. XbaI-Typ, wie z. B. die Stämme der Ausbrüche in Dobel (LT 29/XbaI 27), in Lüneburg (LT 8/XbaI 43a) und in Stolberg (LT 1/XbaI 34). Es gab darüber hinaus auch sporadische Isolate vom Mensch und von verschiedenen Tierarten (n = 150) mit Lyso-/XbaI-Typ-Kombinationen, die bei verschiedenen Ausbruchsstämmen gefunden wurden. Das könnte auf eine Verbreitung und lange Persistenz dieser Klone hindeuten. Andere sporadische Isolate (n = 86) hingegen wiesen verschiedene Lyso- und XbaI-Typ-Kombinationen auf. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass durch die komplexe Typisierung eine bessere Diskriminierung von S. Infantis-Stämmen möglich wird und dadurch auch eine eindeutigere Erkennung von Ausbrüchen. Bei 50 untersuchten Ausbrüchen (40 Lebensmittelvergiftungen und 10 Hospitalinfektionen, insgesamt 187 Stämme) wurden 12 Lysotypen nachgewiesen. Bei mehreren dieser Ausbrüche wurde der Klon LT 29/XbaI 27 identifiziert, der vermehrt bei Masthähnchen vorkommt. Besonders bemerkenswert ist das Auftreten von S. Infantis als nosokomialer Erreger von Hospitalausbrüchen in deutschen Kliniken. Beispielsweise traten in einer Klinik in Baden-Württemberg seit 2002 immer wieder S. Infantis-Stämme des LT 29/XbaI 27 auf. Eine Lebensmittelvergiftung mit 188 Erkrankten in zwei Krankenhäusern wurde im Jahr 2004 in Bayern durch Backwaren verursacht. Mittels Lysotypie und PFGE konnten alle Stämme von Menschen und Lebensmitteln als LT 53/XbaI 6 charakterisiert werden. Die überwiegende Anzahl der S. Infantis-Infektionen sind lebensmittelbedingt. Bei zwei Ausbrüchen in Nordrhein-Westfalen in den Jahren 2007 und 2008, die durch Schweinebraten und Geflügeldöner verursacht wurden, sind die S. Infantis-Klone LT 1/XbaI 34a und LT 1/XbaI 34 identifiziert worden. Der Typ LT 1/XbaI 34 wurde auch bei Schweinen und bei Masthähnchen nachgewiesen. Die komplexe Typisierung beweist, dass beide Tierspezies als Infektionsquellen für S. Infantis dienen. Eine überregionale Häufung von S. Infantis-Meldungen aus Thüringen, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen fielen im Oktober 2007 auf, wobei alle S. Infantis-Isolate bezüglich des Lyso-/XbaI-Typs (LT 29/XbaI 27a) identisch waren. Somit lassen sich durch kontinuierliche komplexe Typisierung von S. Infantis-Isolaten auch diffuse Ausbrüche erfassen. Der Serovar S. Infantis ist in Geflügelbeständen weit verbreitet. Isolate aus Masthähnchen, die aus Deutschland, Ungarn und Island stammten, wurden typisiert und in 24 Lysotypen eingeordnet. In Deutschland dominierten bei Masthähnchen Stämme mit folgenden Typisiermustern, LT 4/XbaI 4, LT 29/XbaI 5 und LT 29/XbaI 27. Die Stämme mit der Kombination LT 29/XbaI 5 stammten ursprünglich aus Ungarn. Im Gegensatz dazu wurde bei isländischen Isolaten aus Masthähnchen der bisher in Deutschland und Ungarn nicht vorkommende Lysotyp 61 nachgewiesen. Die Lysotypie weist sowohl darauf hin, dass S. Infantis-Stämme zwischen verschiedenen Ländern zirkulieren als auch darauf, dass es länderspezifische epidemiologische Prozesse gibt. Die Antibiotikaresistenz-Testung gegen 17 Antibiotika ergab, dass 68 % der S. Infantis-Stämme sensibel oder einfachresistent und nur 21 % mehrfachresistent sind. Besorgniserregend war, dass zum ersten Mal vier Isolate des Serovars S. Infantis gefunden wurden, die über eine Extended-Spectrum Beta-Lactamase-vermittelte Resistenz gegen Cephalosporine verfügten, was durch PCR und Sequenzierung bestätigt wurde. Diese mehrfachresistenten Stämme mit den ESBL-Typen CTX-M-1 bzw. TEM-52 gehören zu den häufig vorkommenden Lysotypen LT 1 und LT 29, die auch bei Masthähnchen und Mastschweinen verbreitet sind. Die ESBL-Resistenz bei S. Infantis in Deutschland sollte weiter beobachtet werden. Der routinemäßige Einsatz des entwickelten Lysotypieschemas für den S. Infantis-Serovar wird dazu beitragen, die epidemiologische Analyse zu verbessern.

Aus Materialien einer mesophilen Biogasanlage wurden Untersuchungen zur natürlichen Inaktivierung von Salmonellen durchgeführt. In dieser Biogasanlage werden zur alternativen Energiegewinnung im zweistufigen Prozess Rinderflüssigmist, Hühnerkot und Fettabscheiderinhalte fermentiert. Insgesamt konnten in den Jahren 1997-2000 zwölf verschiedene Salmonella-Serovare (z. B. S. Enteritidis, S. Agona, S. Hadar) in den Ausgangsmaterialien, im Fermentationsmaterial und im fertigen Fermentationsprodukt isoliert werden. Salmonella-positiv waren die Proben zu 95,5% (n = 22) aus der Rindergülle, zu 69,2% (n =13) aus dem Fermenter I, zu 50% (n = 20) aus dem Fermenter II, zu 77,3% (n = 22) aus der Lagune und zu 40% (n = 10) aus dem Fettabscheider. Als Quellen der Salmonellen werden die Gülle der Milchviehanlage (besonders für den Impfstamm) sowie Fettabscheiderinhalte diskutiert. Nach einer Infektion von Rindern mit S. Typhimurium in der gülleliefernden Milchviehanlage war nach der Vakzinierung der Kälber der Zoosaloral®-Impfstamm (LT: DT009) in der Gülle häufig nachweisbar. Bei 13 Untersuchun-gen wurde der Impfstamm zwölfmal in der Gülle der Milchviehanlage, einmal im Fermentationsprodukt der Biogasanlage und in fünf Proben aus der Lagune isoliert. Im Laboratorium wurde das Absterben von S. Typhimurium DT104 in fermen-tierender Rindergülle bei Lagerungstemperaturen von 7°C, 22°C und 37°C un-tersucht. Nach durchschnittlich 10 Tagen waren bei 37°C – dies entspricht etwa der Betriebstemperatur einer mesophilen Biogasanlage – keine Salmonellen nachweisbar. Bei einer Temperatur von 22°C überlebten die Salmonellen neun Wochen, bei 7°C überlebten sie mehr als 52 Wochen. Der mikrobiologische Abbau von Biomasse führt zur Aufspaltung der Makro-moleküle und danach zur Bildung von Karbonsäuren. Nach der Analyse orga-nischer Säuren aus Rindergülle und Cosubstraten wurden Konzentrationen dieser Säuren gegen S. Typhimurium DT104 experimentell geprüft. Es wurde der Einfluss von Ameisen-, Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, Valerian-, Iso-valeriansäure auf die Inaktivierung von S. Typhimurium DT104 untersucht. In Versuchen mit den Einzelsäuren und Dosen der Salmonellen, die über den Gehalten nativer Gülle lagen, konnte eine Inaktivierung erst bei Konzentratio-nen von 10 bis 40 g/l erzielt werden. Da diese Konzentrationen laut der zu Grunde gelegten Gülleanalyse in den jeweiligen Einzelfällen nicht erreicht wurden, erfolgte die Prüfung der Säuren gegenüber den Salmonellen im Kom-plex. Dazu wurde ein Säuregemisch hergestellt, das den ermittelten Konzentra-tionen der Säuren in der Rindergülle plus Cosubstraten entspricht und auf ei-nen pH-Wert von 7,3 eingestellt. In dieser Säurelösung wurden Salmonellen täglich um durchschnittlich 0,5 Zehnerpotenzen reduziert und in drei Ver-suchsansätzen innerhalb von durchschnittlich 17 Tagen inaktiviert. Mit diesen Daten wird der Einfluß von in der Gülle vorkommenden Konzentrationen or-ganischer Säuren auf S. Typhimurium DT104 erstmals quantifiziert. Aus den Untersuchungen wird der Schluß gezogen, dass für das Absterben von S. Typhimurium DT104 während der 24 bis 33 Tage andauernden natürlichen Fermentation der Gülle in der Biogasanlage der Anstieg und der Einfluß der Karbonsäuren sehr wesentlich ist. Die nach der Vakzinierung der Kälber mit dem Lebendimpfstoff Zoosaloral® ausgeschiedenen Salmonellenimpfstämme waren auch nach Passage der Bio-gasanlage durch ihr auxotrophes Verhalten sicher von Wildstämmen zu unter-scheiden. Bei der Untersuchung von Gülle aus mit Salmonella-Lebendvakzinen geimpften Rinderbeständen ist das Mitführen des Bovisal-Diagnostikums® zu empfehlen. Bei den natürlich vorkommenden Salmonellen-Serovaren wurden zahlreiche Resistenzen gegenüber unterschiedlichen Antibiotika festgestellt. Die Zoosalo-ral®-Impfstämme wiesen nach der Passage der Biogasanlage keine veränderten Resistenzen auf. Die Zoosaloral®-Impfstämme sind resistent gegen Spectinomy-cin, Erythromycin und Penicillin. / We investigated the natural inactivation of Salmonella in the stuff of a meso-philic biogas plant where cattle slurry, poultry waste and fat separator contents are fermented in a two-step process for the use of alternative energy recovery. From 1997 to 2000 we isolated 12 different Salmonella serovars (e. g. S. Enteriti-dis, S. Agona, S. Hadar) in the native sludge, in the fermenter material and in the fermentation product. The following parts of the samples were Salmonella-positive: cattle slurry 95,5% (n = 22), fermenter I 69,2% (n =13), fermenter II 50% (n = 20), storage tank 77,3% (n = 22), and fat separator 40% (n = 10). As source of the Salmonella we assume the slurry of the dairy cattle farm (esp. in the case of vaccine strains) and the fat separator contents. After an infection of cattle with S. Typhimurium in the sludge-producing farm and vaccination of calves with Zoosaloral® the vaccine strain (LT: DT009) was frequently found in the slurry. In the course of 13 tests we isolated the vaccine strain in 12 samples of the biogas plant slurry, in one sample of the fermenta-tion product and in 5 samples of the storage tank. In laboratory investigations we studied the inactivation of S. Typhimurium DT104 in fermented cattle slurry at storage temperatures of 7°C, 22°C, and 37°C. After a mean storage time of 10 days at 37°C (i.e. the working tempera-ture of the biogas plant) all Salmonella were inactivated. At 22°C they survived nine weeks, at 7°C more than 52 weeks. The microbiologic degradation causes the splitting of macromolecules and the formation of free volatile acides (VFA). After analysis of the VFA in cattle slurry and cosubstrates we tested different concentrations of formic, acetic, propionic, butyric, isobutyric, valerianic, and isovalerianic acid. In tests with the single acids and Salmonella concentrations higher than in native slurry an inactivation was achieved at acid concentrations between 10-40 mg/l. Because acid concen-trations in native sludge are lower, we examined an acid mixture with acid con-centrations equivalent to cattle slurry/cosubstrate at pH 7,3. In the mixture Salmonalla were daily reduced about 0,5 orders and inactivated in an average of 17 days. These data quantify the influence of VFA concentrations in slurry for the first time. We concluded that the increase and the influence of VFA are very important for the inactivation of S. Typhimurium DT104 during the 24-33 days of slurry fer-mentation in the biogas plant. After vaccination of calves with the live vaccine Zoosaloral® the excreted Salmonella vaccine strains could be distinguished after the passage of the biogas plant by their auxotrophy from wild strains. We rec-ommend the use of Bovisaloral-Diagnostikum® for investigations of slurry from cattle vaccinated with Salmonella live vaccine. The natural Salmonella serovars were resistant against numerous antibiotics. The Zoosaloral® vaccine strains showed no deviating resistances after passag-ing the biogas plant. The Zoosaloral® vaccine strains were spectinomycine-, erythromycine- and penicilline-resistent.

Die vorliegende Studie bestätigt, dass Fernreisen, insbesondere in Regionen mit hoher ESBL-Prävalenz, nach wie vor ein hohes ESBL-PE-Kolonisationsrisiko aufweisen. Am meisten betroffen sind Reisende ins südliche Asien (indischer Subkontinent) und nach Südostasien. Die spontane ESBL-Dekolonisation erfolgt in der Regel innerhalb der ersten Wochen nach Rückreise. Nach sechs Monaten ist der Großteil der kolonisierten Reisenden wieder „frei“ von ESBL-PE. Unsere Studie zeigt, dass sowohl das Alter der Reisenden, als auch die Art der Unterkunft eine wichtige Rolle bei der Kolonisation mit ESBL-PE spielt. Junge Reisende im Alter von 20-29 Jahren und Reisende, die in einem Hotel oder einer privaten Unterkunft wohnen, sind einem signifikant höheren Risiko für eine Kolonisation mit ESBL-PE ausgesetzt.

In dieser Arbeit wurden 104 stationär isolierte Stämme mit 90 ambulant isolierten Stämmen hinsichtlich ihrer Antibiotikaresistenz und ihrer Ribotypenzugehörigkeit verglichen. Die Proben stammten aus den Jahren 2011 bis 2019, wobei keine stationären Isolate aus dem Jahr 2014 aufzufinden waren, woraufhin aus Gründen der Vergleichbarkeit auch auf ambulante Proben aus diesem Jahr verzichtet wurde. Unter den Isolaten gab es 90 Paare, die sich in Geschlecht, Toxinaktivität, Patientenalter und Datum des Auftretens der Infektion vergleichen ließen. Die 14 übrigen stationären Proben flossen ebenfalls in die Auswertung ein. Folgendes wurde beobachtet: - Die Mehrheit (70%) aller untersuchten Isolate stammte von Patienten, deren Alter zum Erkrankungszeitpunkt zwischen 60 und 90 Jahren lag. - Frauen (57%) waren etwas häufiger betroffen als Männer (43%). Es wurde die minimale Hemmkonzentration (MHK) für die Antibiotika Vancomycin, Metronidazol, Moxifloxacin und Tigecyclin mittels E- Test- Streifen ermittelt sowie die MHK für die Antibiotika Rifaximin und Fidaxomicin mittels Agardilution. Zudem wurde der Ribotyp jedes Stammes anhand der PCR- Ribotypisierung bestimmt. Aus den Untersuchungen ergaben sich die folgenden Ergebnisse: - Im ambulanten Bereich war der RT027 mit 21% am häufigsten vertreten, gefolgt vom RT078 (18%), RT001 (11%) und RT014 (10%). Auch im stationären Bereich war der RT027 mit 30% am häufigsten vertreten, gefolgt vom RT014 (18%), RT001 (12%) und RT078 (8%). - Die Isolate zeigten eine sehr hohe Sensibilität gegenüber Vancomycin (100% der Isolate sensibel), Tigecyclin (97% der Isolate sensibel) und Fidaxomicin (92% der Stämme mit einer MHK</= 0,125 mg/l). - Gegenüber Metronidazol zeigten 22% eine MHK > 2 mg/l. Vor allem die Ribotypen 027 (63% resistent) und 001 (35% resistent) zeigten eine hohe Resistenzlage. Die Ribotypen 078 und 014 waren zu 100% Metronidazol- sensibel. - Gegenüber Moxifloxacin waren 43% der Isolate mit einer MHK > 4 mg/l resistent. Auch hier zeigten die Ribotypen 027 (88% resistent) und 001 (95% resistent) eine hohe Resistenzlage, wohingegen 70% der RT078 und 86% der RT014 Moxifloxa-cin- sensibel waren. - Unter Ausschluss des RT027 waren 95% der Stämme sensibel gegenüber Rifaximin. Von den RT027- Isolaten hingegen waren nur 8% sensibel. Gerade hier empfiehlt sich der Ausschluss eines RT027 vor Beginn einer Rifaximintherapie. Unter Zusammenschau der Eigenschaften der Patientenproben und den ermittelten Resistenzen und Ripotypen können zudem folgende Aussagen aufgestellt werden: - Das Durchschnittsalter der Patienten mit einer RT001-, einer RT027- und CD12- Infektion war im stationären Bereich höher; das der Patienten mit einer RT078-, RT014- und CD6- Infektion war im ambulanten Bereich höher. - Die Resistenzlage im Jahr 2012 war für die Antibiotika Metronidazol, Moxifloxacin und Rifaximin im Vergleich zu den anderen Jahren deutlich erhöht. Es konnte in den letzten drei Untersuchungsjahren eine leicht abnehmende Tendenz Rifaximin- resistenter Stämme beobachtet werden. Für alle anderen Antibiotika konnte weder eine Zu- noch eine Abnahme des Auftretens resistenter Stämme nachgewiesen werden. - In den letzten beiden Untersuchungsjahren nahm der Anteil der RT027- Isolate ab, wohingegen seit 2013 eine stete Zunahme des Auftretens des RT078 zu beobachten war. - Das durchschnittliche Alter der Patienten mit einer RT027- Infektion lag 5,1 J. über dem Gesamtdurchschnitt. Vancomycin und Metronidazol gelten schon lange als Mittel der Wahl zur Therapie einer CDAD. Sie gelten als wirksam und vergleichsweise preiswert. In der Kosten- Nutzen- Abwägung wurden auch die vier anderen Antibiotika berücksichtigt. Es ergaben sich die folgenden Ergebnisse: - Unter der Voraussetzung, dass der Ribotyp des zu therapierenden C. difficile- Stammes nicht bekannt ist, bleibt Vancomycin sowohl bei milden als auch bei schweren Verläufen ein günstiges Mittel der Wahl. - Vor Therapie mit dem Antibiotikum Metronidazol ist der Ausschluss eines RT027 sinnvoll. Handelt es sich nicht um diesen Ribotyp, hat auch Metronidazol mit großer Wahrscheinlichkeit eine gute Wirksamkeit und kann Vancomycin möglicherweise vorgezogen werden (preiswerter, keine Züchtung Vancomycin- resistenter Stämme). - Fidaxomicin hat eine sehr gute Wirksamkeit gegenüber den häufigsten Ribotypen. Derzeit ist eine Fidaxomicintherapie etwa zehnmal teurer als eine Therapie mit Vancomycin. - Wenn ein RT027- Ausschluss erfolgt ist, kann eine Therapie mit Rifaximin erwogen werden (günstiger als Vancomycin, gute Verträglichkeit aufgrund lokaler Wirkung). Die Arbeit hat gezeigt, dass es sowohl im ambulanten als auch im stationären Bereich eindeutig Korrelate zwischen der Ribotypenzugehörigkeit und dem Vorliegen von Antibiotikaresistenzen gibt. Bereits nach Ausschluss der Ribotypen 027 und 001 können Therapieempfehlungen angepasst werden. Teilweise ändert sich die Therapieoption auch unter Berücksichtigung des Ortes der Probengewinnung. In schwierigen Fällen ist eine Therapie nach Ribotypisierung durchaus sinnvoll, da durch eine gezielte Antibiose Rezidive und Resistenz-bildungen vermieden werden. Zusammenfassend zeigt sich, dass flächendeckenden Surveillanceprogrammen, insbesondere dem Mapping virulenter Keime, eine große Bedeutung zugesprochen werden kann. Ihr Fortbestehen und der weitere Ausbau dienen der sinnvollen Therapie des Einzelnen, aber auch der Vorbeugung schwerwiegender Krankheitsausbrüche und Epidemien.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Eigenschaften und Epidemiologie von Clostridium difficile 1.2 Vorkommen und Übertragungswege 1.3 Klinik, Verlaufsformen und Risikofaktoren 1.3.1 Pathogenese 1.4 Diagnostik einer CDI 1.5 Therapie und Prophylaxe 1.6 Antibiotika und Resistenzen 1.6.1 Vancomycin 1.6.2 Metronidazol 1.6.3 Moxifloxacin 1.6.4 Tigecyclin 1.6.5 Rifaximin 1.6.6 Fidaxomicin 1.7 Typisierungsmethoden 1.8 PCR- Ribotypisierung 1.9 Eigenschaften der Ribotypen 027, 078, 001 und 014 1.10 Entwicklung der letzten Jahre 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIALIEN 3.1 ständig eingesetzte Materialien 3.2 Identifizierung von C. difficile aus Stuhlproben und Isolation 3.3 Beimpfen der Agarplatten mit C. difficile und Bebrütung 3.4 Legen der E- Test- Streifen und Ansetzen der DNA 3.5 Agardilution 3.6 PCR- Ribotypisierung 4 METHODEN 4.1 Patientenstämme 4.1.1 Herkunft der Patientenstämme 4.1.2 Identifizierung von C. difficile aus Stuhlproben und ihre Isolation 4.1.3 Verwendete Isolate 4.2 Beimpfen der Agarplatten mit C. difficile und Bebrütung 4.3 Legen der E-Test- Streifen und Ansetzen der DNA 4.4 Agardilution 4.5 PCR- Ribotypisierung 4.5.1 Polymerase- Kettenreaktion 4.5.2 Ribotypisierung 4.6 Allgemeine Aspekte 5 ERGEBNISSE 5.1 Auswahl der Patientenproben 5.1.1 Toxineigenschaften 5.1.2 Verteilung im Hinblick auf das Patientengeschlecht und das Labor 5.1.3 Verteilung im Hinblick auf das Patientenalter 5.2 Antibiotika- Sensibilität 5.2.1 Klinische Grenzwerte nach EUCAST 5.2.2 Antibiotikaresistenzen der einzelnen Stämme unter Berücksichtigung ihrer Herkunft 5.2.3 Resistenzkombinationen der einzelnen Stämme und ihre Ribotypen 5.3 Ribotypisierung 5.3.1 Isolate des RT027 genauer betrachtet 5.3.2 Isolate des RT078 genauer betrachtet 5.3.3 Isolate des RT001 genauer betrachtet 5.3.4 Isolate des RT014 genauer betrachtet 5.3.5 Diversität der Ribotypen im zeitlichen Verlauf 5.4 Antibiotikasensibilität und Ribotypen im Zusammenhang betrachtet 5.4.1 Vancomycin 5.4.2 Metronidazol 5.4.3 Moxifloxacin 5.4.4 Tigecyclin 5.4.5 Fidaxomicin 5.4.6 Rifaximin 6 DISKUSSION 6.1 Patientenproben, Anzucht, Wachstum 6.2 Toxin- negative Isolate 6.3 Antimikrobielle Empfindlichkeit 6.4 Genotypische Charakteristika 6.5 Antimikrobielle Empfindlichkeit und genotypische Charakteristika im Zusammenhang, Therapieempfehlungen 6.6 Finanzieller Aspekt einer Therapie 7 ZUSAMMENFASSUNG 8 LITERATURVERZEICHNIS 9 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 9.1 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 10 CURRICULUM VITAE 11 DANKSAGUNG

Antibiotics have been one of the greatest scientific discoveries for humanity. Their great success has been hindered by the increasing of antibiotic resistance events. Conventional wisdom considers antibiotic resistance as a strictly clinical issue. In reality, more and more studies have proven that non-clinical environments, especially aquatic environments, are critical factors for the spread of antibiotic resistance. Antibiotic resistance genes (ARGs) are usually located on mobile genetic elements, which can disseminate among taxonomically unconnected species. Therefore, environmental bacteria can serve as hotspots for the development and dissemination of antibiotic resistance. The aim of this thesis is to determine how human originated pollution affects the antibiotic resistance abundance in the surrounding water environments. The case studies were three example environments, wastewater treatment plants (WWTPs), receiving river bodies and combined sewer overflows (CSOs). Molecular microbiology methods have been applied to analyse the resistance levels of bacterial communities from WWTP, CSOs and wastewater affected environments at different European geographical locations. Additionally, a novel approach consisting in an amplicon sequencing is described, in order to be able to investigate and asses the composition of a significant amount of integron gene cassettes. Findings consistently indicate that effluents originated from WWTPs and CSOs have a significant impact on the levels of ARGs of the receiving water bodies. Moreover, this thesis suggests that gene blaOXA-58, could be utilized as a proxy to investigate the spread of ARGs. Its occurrence has been reported to show, consistently throughout the chapters, lower concentrations upstream, but at higher concentrations in the WWTP effluent, CSOs and downstream of the effluent. In conclusion, although antibiotic resistance genes and integrons are part of the environmental resistome, water environments that are affected by anthropogenic wastewater display high levels of the above-mentioned genetic elements. These findings clearly suggest the need to limit pollution levels, as well as the need to establish a more responsible policy in antibiotic prescriptions. This must take place in order to be able to perform efficient risk assessments and to establish acceptable levels of antibiotic and ARGs pollution.:List of Figures VII List of Tables IX List of Abbreviations X 1. Introduction 11 1.1 Antibiotic resistance: an increasing problem 11 1.2 Intrinsic antibiotic resistance and horizontal gene transfer 13 1.2.1 Transformation 13 1.2.2 Transduction 13 1.2.3 Conjugation 14 1.3 Gene transfer elements 14 1.4 Antibiotic resistance and anthropogenic impact on surrounding environments 16 1.5 Study goals 17 2. Genetic variations of the resistome of wastewater treatment plants driven by the seasonality of antibiotic prescription 18 2.1 Introduction 18 2.2 Materials and methods 19 2.3 Results and discussion 20 3. Assessment of inter-laboratory variations of quantitative analyses of antibiotic resistance genes 27 3.1 Introduction 27 3.2 Materials and methods 27 3.3 Results and discussion 30 3.4 Conclusions 36 4. Antibiotic resistance genes in treated wastewater and in the receiving water bodies: A pan-European survey of urban settings 37 4.1 Introduction 37 4.2 Materials and methods 38 4.3 Results 44 4.4 Discussion 49 4.5 Conclusions 53 5. Analysis of integron gene cassettes composition in treated wastewater 55 5.1 Introduction 55 5.2 Materials and methods 55 VI 5.3 Results 56 5.4 Discussion 57 6. Role of combined sewer overflows in the dissemination of antibiotic resistance in surrounding environments 59 6.1 Introduction 59 6.2 Materials and methods 60 6.3 Results 61 6.4 Discussion 66 7. Closing Conclusions 68 References 70 List of publications 88 Note on the commencement of the doctoral procedure 89 Acknowledgments 90

Almost two hundred years ago, Dr John Snow identified the faecal contaminated water as a source of bacterial infections during a severe cholera outbreak. Several years later, we have developed many weapons on our arsenal to reduce the bacterial infections, from simple ones such as public hygiene measures (e.g. frequent showers & hand washing, clean water), to specialised ones such as the use of antibiotics. The antibiotics inhibit the bacterial growth, thus their use has effectively helped to treat many bacterial infections, revolutionizing medicine. Successful recovery from surgical operations would be seldom and would last exponentially without their use. Yet, antimicrobial resistance (AMR) has increased globally threatening to render antibiotics useless. However, the “golden era” of novel antibiotics development, when many novel antibiotics were discovered in a few years, belongs to the past. The bacteria developed resistance mechanisms to every single one of the antibiotics and rendered them useless. This could be reflected to an increase in the death rates, but more importantly to the increased health-care costs, which might compromise the treatment for other diseases. The Covid-19 pandemic provided such a clear paradigm on the straining of health care systems during massive parallel hospitalisation of patients. While, the misuse of antibiotics for human and veterinary was the main contributor of the increased AMR levels, other anthropogenic activities greatly contributed to AMR spread as well. Specifically, the wastewater treatment plants are considered as hotspots for AMR and agricultural practices, such as manure amendment, have been show to clearly promote AMR. Thus, the scientific community across clinical settings, environmental and agricultural sectors intensively researches on AMR, in an attempt to fully understand the AMR phenomenon. Nevertheless, the AMR is not the only problem that currently occurs in our society. The climate change, the urbanisation and the ever increasing human population has caused an increasing freshwater scarcity. The demand for treated wastewater (TWW) irrigation has increased due to this freshwater scarcity, and is expected to increase more. Since the TWW contains a high load of antibiotics, antibiotic resistant bacteria (ARB) and antibiotic resistance genes (ARGs), the irrigation with TWW has raised concerns regarding AMR spread in the environment. Many studies have attempted to investigate the impact of TWW on AMR spread in crops and soil; however, the impact on deeper lying environments remains not yet elucidated. This should raise concerns, since groundwater remains the most valuable drinking water source globally. Here in this thesis, I attempted to gain further understanding on whether TWW irrigation promotes the AMR spread in the soil and the so-far neglected deeper-lying subsurface environments. My outmost desire is that the present work will contribute to a framework of minimising the potential risks during TWW irrigation, rendering TWW irrigation as a safe and sustainable alternative for freshwater resources depletion.

The increase of antibiotic resistance against antibiotics (AB) is an alarming phenomenon threatening the human well being and heading back to the pre-antibiotic era where many infectious diseases may become again untreatable with antibiotics. There is a strong correlation between AB use and occurrence of resistances which suggests anthropogenically-driven environments as reservoirs of antibiotic resistant bacteria (ARB). Among anthropogenically - driven environments, wastewater treatment plants (WWTPs), have been linked with the increased incidence of pathogens and ARB in freshwater ecosystems. Principal goal of the study was to evaluate the role of WWTPs as environmental reservoirs for antibiotic resistance and pathogenic bacteria. In this thesis, classical and molecular microbiology methods were applied to analyse resistance levels of bacterial communities from wastewater and wastewater-polluted environments at different geographical locations of developed (German and Switzerland) and developing (Nigeria) countries. Additionally, a novel approach which makes use of a combination of quantitative genomics, Next Generation Sequencing and drug-related health data was applied to quantitatively detect antibiotic resistance genes (ARG) in wastewater and assess their seasonal dynamics. The relative abundance of ARG was not reduced by the WWTPs in the treated effluent. Effluents were responsible for significantly high levels of ARB and ARG in the receiving environment because capable of introducing and/or selecting ARB carrying ARG on genetic mobile elements. The ARG levels differed between seasons independently from the water sanitation. High ARG levels were displayed in autumn and winter in coincidence with the higher uptake of antibiotics by the outpatients of the municipality.Contrary to the ARG, the abundance of bacteria was reduced by WWTPs processes in the effluent of developed countries. The WWTPs were also responsible for the changes of the microbial community from the wastewater to the effluent. Contrary to developed countries, the poor treatment of wastewater in Nigeria facilitated the spread of multi-drug resistant pathogens in the freshwater ecosystem. These bacteria were also carriers of clinically relevant ARG contributing to the accumulation of multiresistant pathogens in the environment. All in all, this thesis shows that well established WWTP technologies are not capable to prevent or reduce the abundance of ARG in the freshwater ecosystem and poorly treated wastewater enriches the environmental reservoirs of ARG. Antibiotic resistance can spread across taxonomically distant bacteria and therefore explain the strong dispersal of ARG in wastewater effluents. These results show that antibiotic resistances are also ubiquitous in the freshwater environment and that anthropogenically - driven environments determine the incidence of antibiotic resistance. As for the clinic, tackling the problem of antibiotic resistance in the environment is fundamental. Without any action, the environmental reservoirs of resistance will increase and therapeutic failure in the clinic will irreversibly compromise the biggest progress in medicine of the 20th century.