ZUSAMMENFASSUNG Haukur Lindberg Sigmarsson PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen. Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h. sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und wenn positiv auch mittels PCR untersucht. Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten Woche post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch und wie erwartet wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.

ZUSAMMENFASSUNG Haukur Lindberg Sigmarsson PATHOGENITÄTSVERGLEICH VON SALMONELLA TYPHIMURIUM DT104 - WILDTYP UND SALMONELLA TYPHIMURIUM - DELETIONSMUTANTEN (sseD::aphT & invC::aphT) IN PERSISTENT INFIZIERTEN SCHWEINEN Salmonella (S.) Typhimurium DT104 ist ein gram-negatives Bakterium. Es weist keine Wirtsspezifität auf und gilt als Zoonoseerreger. Jährlich erkranken daran allein in Deutschland mehrere Tausend Menschen unter dem Bild einer schwerwiegenden Diarrhö mit zum Teil tödlichem Ausgang. Das Schwein gilt als eines der Reservoire für S. Typhimurium DT104 des Menschen. S. Typhimurium DT104 gelangt über vom Schwein stammende Produkte in den menschlichen Verzehr. Die Kontrolle von S. Typhimurium DT104 einschließlich effektiver Eradikationsmassnahmen in unseren Schweinebeständen ist deshalb von entscheidender Bedeutung, um den Eintrag dieses Bakteriums in die menschliche Nahrungskette wenn möglich zu eliminieren. Dafür ist das Verständnis über S. Typhimurium DT104 einschließlich der Kenntnis seine Pathogenitätseigenschaften notwendig. Ziel dieser Arbeit waren Untersuchungen zur Pathogenität von S. Typhimurium DT104. Dabei wurden der Wildstamm mit zwei seiner Deletionsmutanten (sseD::aphT und invC::aphT) verglichen. Die Untersuchungen erfolgten im Infektionsversuch an insgesamt 25 sechs Wochen alten männlichen Schweinen, die in einem vollklimatisierten Versuchsstall gehalten wurden. Den Tieren wurde im Anschluss an eine einwöchige Akklimatisierungsphase eines der nachfolgenden Stämme von S. Typhimurium DT104 oral in einer Konzentration von 1 x 1011 KBE verabreicht: Wildtyp (n = 8 Schweine), Deletionsmutante seeD::aphT (n = 8) und Deletionsmutante invC::aphT (n = 9). Bei den Mutanten handelt es sich um Varianten von S. Typhimurium DT104, die an den entsprechenden Abschnitten des Bakteriumgenoms (d.h. sseD-Gen bzw. invC-Gen) deletiert wurden. SseD regelt die Überlebensfähigkeit von S. Typhimurium in Makrophagen, invC dessen Invasionsvermögen. Im Mäusemodel war die Pathogenität beider Mutanten deutlich vermindert. Nach der Infektion schloss sich ein 20 tägiger Beobachtungszeitraum an, während dessen nachfolgend genannte Parameter erfasst bzw. Proben genommen wurden: klinische Symptome (Allgemeinbefinden, Erbrechen, Durchfall, Futteraufnahme, Atmung, Temperatur); Blutentnahme für Erstellung des weißen Blutbildes; Kotentnahme zum Nachweis der Ausscheidung von S. Typhimurium. Einen Tag nach Ende der Beobachtung wurden die Tiere getötet und Proben von insgesamt 15 Organen (unter anderem Tonsille; Colon und Caecum sowie dazugehörige Lymphknoten; Leber; Milz; Muskulatur) genommen. Kot sowie Gewebeproben wurden kulturell und wenn positiv auch mittels PCR untersucht. Alle mit dem Wildtyp infizierten Schweine wurden mehr oder weniger stark krank. Häufig zeigten erkrankte Schweine zeitgleich mehrere Krankheitssymptome (z. B. Erbrechen und Durchfall). Die Erkrankung hielt über mehrere Tage an. Im Vergleich dazu waren die Krankheitssymptome der Tiere, die mit Mutanten infiziert wurden, mild. Nur wenige Tiere erkrankten und dann auch nur kurzzeitig. Gewöhnlich war nur einer der erfassten Parameter verändert. Typische Veränderungen im weißen Blutbild waren nur bei Wildtyp-infizierten Tieren zu beobachten, während Tiere beider Mutanten kaum auf die Infektion reagierten. Alle 25 infizierten Tiere schieden S. Typhimurium mit dem Kot während der ersten Woche post inocculationem aus. Danach wurden in allen drei Gruppen etwa gleichviel intermittierende Ausscheider beobachtet. Zwischen 65 und 67 % der Gewebeproben der mit dem Wildtyp und mit der sseD::aphT-Mutante infizierten Tiere waren sowohl in der Kultur als auch mittels PCR S. Typhimurium positiv, während dieser Anteil nach Infektion mit invC::aphT nur 49 % betrug. Alle Tiere waren in Mandibularlymphknoten und im Colon positiv, während S. Typhimurium nur selten in Muskulatur und Leber nachzuweisen war. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Infektionen mit dem Wildtyp von S. Typhimurium zu einer schweren Erkrankung führen können. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass beide in dieser Arbeit verwendeten Mutanten weniger krankmachend sind. Es muss davon ausgegangen werden, dass die Deletionen in den sseD bzw. invC-Bereichen tatsächlich zu Veränderungen bestimmter Eigenschaften geführt haben, die Teil der Pathogenitätsmechanismen für das Schwein sind. Im Unterschied zur Maus war sseD beim Schwein allerdings invasiv. Es kann vermutet werden, dass die durch sseD kodierten Pathogenitätseigenschaften von S. Typhimurium bei der Maus anders als beim Schwein wirken und somit unterschiedliche Bedeutung haben. Da die invC::aphT-Mutante jedoch und wie erwartet wesentlich schwächer als Wildtyp und sseD::aphT invadierte ist davon auszugehen, dass die Deletion im invC Bereich das Invasionsvermögen der Mutante beim Schwein ähnlich wie bei der Maus verringerte.

Aus Materialien einer mesophilen Biogasanlage wurden Untersuchungen zur natürlichen Inaktivierung von Salmonellen durchgeführt. In dieser Biogasanlage werden zur alternativen Energiegewinnung im zweistufigen Prozess Rinderflüssigmist, Hühnerkot und Fettabscheiderinhalte fermentiert. Insgesamt konnten in den Jahren 1997-2000 zwölf verschiedene Salmonella-Serovare (z. B. S. Enteritidis, S. Agona, S. Hadar) in den Ausgangsmaterialien, im Fermentationsmaterial und im fertigen Fermentationsprodukt isoliert werden. Salmonella-positiv waren die Proben zu 95,5% (n = 22) aus der Rindergülle, zu 69,2% (n =13) aus dem Fermenter I, zu 50% (n = 20) aus dem Fermenter II, zu 77,3% (n = 22) aus der Lagune und zu 40% (n = 10) aus dem Fettabscheider. Als Quellen der Salmonellen werden die Gülle der Milchviehanlage (besonders für den Impfstamm) sowie Fettabscheiderinhalte diskutiert. Nach einer Infektion von Rindern mit S. Typhimurium in der gülleliefernden Milchviehanlage war nach der Vakzinierung der Kälber der Zoosaloral®-Impfstamm (LT: DT009) in der Gülle häufig nachweisbar. Bei 13 Untersuchun-gen wurde der Impfstamm zwölfmal in der Gülle der Milchviehanlage, einmal im Fermentationsprodukt der Biogasanlage und in fünf Proben aus der Lagune isoliert. Im Laboratorium wurde das Absterben von S. Typhimurium DT104 in fermen-tierender Rindergülle bei Lagerungstemperaturen von 7°C, 22°C und 37°C un-tersucht. Nach durchschnittlich 10 Tagen waren bei 37°C – dies entspricht etwa der Betriebstemperatur einer mesophilen Biogasanlage – keine Salmonellen nachweisbar. Bei einer Temperatur von 22°C überlebten die Salmonellen neun Wochen, bei 7°C überlebten sie mehr als 52 Wochen. Der mikrobiologische Abbau von Biomasse führt zur Aufspaltung der Makro-moleküle und danach zur Bildung von Karbonsäuren. Nach der Analyse orga-nischer Säuren aus Rindergülle und Cosubstraten wurden Konzentrationen dieser Säuren gegen S. Typhimurium DT104 experimentell geprüft. Es wurde der Einfluss von Ameisen-, Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, Valerian-, Iso-valeriansäure auf die Inaktivierung von S. Typhimurium DT104 untersucht. In Versuchen mit den Einzelsäuren und Dosen der Salmonellen, die über den Gehalten nativer Gülle lagen, konnte eine Inaktivierung erst bei Konzentratio-nen von 10 bis 40 g/l erzielt werden. Da diese Konzentrationen laut der zu Grunde gelegten Gülleanalyse in den jeweiligen Einzelfällen nicht erreicht wurden, erfolgte die Prüfung der Säuren gegenüber den Salmonellen im Kom-plex. Dazu wurde ein Säuregemisch hergestellt, das den ermittelten Konzentra-tionen der Säuren in der Rindergülle plus Cosubstraten entspricht und auf ei-nen pH-Wert von 7,3 eingestellt. In dieser Säurelösung wurden Salmonellen täglich um durchschnittlich 0,5 Zehnerpotenzen reduziert und in drei Ver-suchsansätzen innerhalb von durchschnittlich 17 Tagen inaktiviert. Mit diesen Daten wird der Einfluß von in der Gülle vorkommenden Konzentrationen or-ganischer Säuren auf S. Typhimurium DT104 erstmals quantifiziert. Aus den Untersuchungen wird der Schluß gezogen, dass für das Absterben von S. Typhimurium DT104 während der 24 bis 33 Tage andauernden natürlichen Fermentation der Gülle in der Biogasanlage der Anstieg und der Einfluß der Karbonsäuren sehr wesentlich ist. Die nach der Vakzinierung der Kälber mit dem Lebendimpfstoff Zoosaloral® ausgeschiedenen Salmonellenimpfstämme waren auch nach Passage der Bio-gasanlage durch ihr auxotrophes Verhalten sicher von Wildstämmen zu unter-scheiden. Bei der Untersuchung von Gülle aus mit Salmonella-Lebendvakzinen geimpften Rinderbeständen ist das Mitführen des Bovisal-Diagnostikums® zu empfehlen. Bei den natürlich vorkommenden Salmonellen-Serovaren wurden zahlreiche Resistenzen gegenüber unterschiedlichen Antibiotika festgestellt. Die Zoosalo-ral®-Impfstämme wiesen nach der Passage der Biogasanlage keine veränderten Resistenzen auf. Die Zoosaloral®-Impfstämme sind resistent gegen Spectinomy-cin, Erythromycin und Penicillin. / We investigated the natural inactivation of Salmonella in the stuff of a meso-philic biogas plant where cattle slurry, poultry waste and fat separator contents are fermented in a two-step process for the use of alternative energy recovery. From 1997 to 2000 we isolated 12 different Salmonella serovars (e. g. S. Enteriti-dis, S. Agona, S. Hadar) in the native sludge, in the fermenter material and in the fermentation product. The following parts of the samples were Salmonella-positive: cattle slurry 95,5% (n = 22), fermenter I 69,2% (n =13), fermenter II 50% (n = 20), storage tank 77,3% (n = 22), and fat separator 40% (n = 10). As source of the Salmonella we assume the slurry of the dairy cattle farm (esp. in the case of vaccine strains) and the fat separator contents. After an infection of cattle with S. Typhimurium in the sludge-producing farm and vaccination of calves with Zoosaloral® the vaccine strain (LT: DT009) was frequently found in the slurry. In the course of 13 tests we isolated the vaccine strain in 12 samples of the biogas plant slurry, in one sample of the fermenta-tion product and in 5 samples of the storage tank. In laboratory investigations we studied the inactivation of S. Typhimurium DT104 in fermented cattle slurry at storage temperatures of 7°C, 22°C, and 37°C. After a mean storage time of 10 days at 37°C (i.e. the working tempera-ture of the biogas plant) all Salmonella were inactivated. At 22°C they survived nine weeks, at 7°C more than 52 weeks. The microbiologic degradation causes the splitting of macromolecules and the formation of free volatile acides (VFA). After analysis of the VFA in cattle slurry and cosubstrates we tested different concentrations of formic, acetic, propionic, butyric, isobutyric, valerianic, and isovalerianic acid. In tests with the single acids and Salmonella concentrations higher than in native slurry an inactivation was achieved at acid concentrations between 10-40 mg/l. Because acid concen-trations in native sludge are lower, we examined an acid mixture with acid con-centrations equivalent to cattle slurry/cosubstrate at pH 7,3. In the mixture Salmonalla were daily reduced about 0,5 orders and inactivated in an average of 17 days. These data quantify the influence of VFA concentrations in slurry for the first time. We concluded that the increase and the influence of VFA are very important for the inactivation of S. Typhimurium DT104 during the 24-33 days of slurry fer-mentation in the biogas plant. After vaccination of calves with the live vaccine Zoosaloral® the excreted Salmonella vaccine strains could be distinguished after the passage of the biogas plant by their auxotrophy from wild strains. We rec-ommend the use of Bovisaloral-Diagnostikum® for investigations of slurry from cattle vaccinated with Salmonella live vaccine. The natural Salmonella serovars were resistant against numerous antibiotics. The Zoosaloral® vaccine strains showed no deviating resistances after passag-ing the biogas plant. The Zoosaloral® vaccine strains were spectinomycine-, erythromycine- and penicilline-resistent.

Aus Materialien einer mesophilen Biogasanlage wurden Untersuchungen zur natürlichen Inaktivierung von Salmonellen durchgeführt. In dieser Biogasanlage werden zur alternativen Energiegewinnung im zweistufigen Prozess Rinderflüssigmist, Hühnerkot und Fettabscheiderinhalte fermentiert. Insgesamt konnten in den Jahren 1997-2000 zwölf verschiedene Salmonella-Serovare (z. B. S. Enteritidis, S. Agona, S. Hadar) in den Ausgangsmaterialien, im Fermentationsmaterial und im fertigen Fermentationsprodukt isoliert werden. Salmonella-positiv waren die Proben zu 95,5% (n = 22) aus der Rindergülle, zu 69,2% (n =13) aus dem Fermenter I, zu 50% (n = 20) aus dem Fermenter II, zu 77,3% (n = 22) aus der Lagune und zu 40% (n = 10) aus dem Fettabscheider. Als Quellen der Salmonellen werden die Gülle der Milchviehanlage (besonders für den Impfstamm) sowie Fettabscheiderinhalte diskutiert. Nach einer Infektion von Rindern mit S. Typhimurium in der gülleliefernden Milchviehanlage war nach der Vakzinierung der Kälber der Zoosaloral®-Impfstamm (LT: DT009) in der Gülle häufig nachweisbar. Bei 13 Untersuchun-gen wurde der Impfstamm zwölfmal in der Gülle der Milchviehanlage, einmal im Fermentationsprodukt der Biogasanlage und in fünf Proben aus der Lagune isoliert. Im Laboratorium wurde das Absterben von S. Typhimurium DT104 in fermen-tierender Rindergülle bei Lagerungstemperaturen von 7°C, 22°C und 37°C un-tersucht. Nach durchschnittlich 10 Tagen waren bei 37°C – dies entspricht etwa der Betriebstemperatur einer mesophilen Biogasanlage – keine Salmonellen nachweisbar. Bei einer Temperatur von 22°C überlebten die Salmonellen neun Wochen, bei 7°C überlebten sie mehr als 52 Wochen. Der mikrobiologische Abbau von Biomasse führt zur Aufspaltung der Makro-moleküle und danach zur Bildung von Karbonsäuren. Nach der Analyse orga-nischer Säuren aus Rindergülle und Cosubstraten wurden Konzentrationen dieser Säuren gegen S. Typhimurium DT104 experimentell geprüft. Es wurde der Einfluss von Ameisen-, Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, Valerian-, Iso-valeriansäure auf die Inaktivierung von S. Typhimurium DT104 untersucht. In Versuchen mit den Einzelsäuren und Dosen der Salmonellen, die über den Gehalten nativer Gülle lagen, konnte eine Inaktivierung erst bei Konzentratio-nen von 10 bis 40 g/l erzielt werden. Da diese Konzentrationen laut der zu Grunde gelegten Gülleanalyse in den jeweiligen Einzelfällen nicht erreicht wurden, erfolgte die Prüfung der Säuren gegenüber den Salmonellen im Kom-plex. Dazu wurde ein Säuregemisch hergestellt, das den ermittelten Konzentra-tionen der Säuren in der Rindergülle plus Cosubstraten entspricht und auf ei-nen pH-Wert von 7,3 eingestellt. In dieser Säurelösung wurden Salmonellen täglich um durchschnittlich 0,5 Zehnerpotenzen reduziert und in drei Ver-suchsansätzen innerhalb von durchschnittlich 17 Tagen inaktiviert. Mit diesen Daten wird der Einfluß von in der Gülle vorkommenden Konzentrationen or-ganischer Säuren auf S. Typhimurium DT104 erstmals quantifiziert. Aus den Untersuchungen wird der Schluß gezogen, dass für das Absterben von S. Typhimurium DT104 während der 24 bis 33 Tage andauernden natürlichen Fermentation der Gülle in der Biogasanlage der Anstieg und der Einfluß der Karbonsäuren sehr wesentlich ist. Die nach der Vakzinierung der Kälber mit dem Lebendimpfstoff Zoosaloral® ausgeschiedenen Salmonellenimpfstämme waren auch nach Passage der Bio-gasanlage durch ihr auxotrophes Verhalten sicher von Wildstämmen zu unter-scheiden. Bei der Untersuchung von Gülle aus mit Salmonella-Lebendvakzinen geimpften Rinderbeständen ist das Mitführen des Bovisal-Diagnostikums® zu empfehlen. Bei den natürlich vorkommenden Salmonellen-Serovaren wurden zahlreiche Resistenzen gegenüber unterschiedlichen Antibiotika festgestellt. Die Zoosalo-ral®-Impfstämme wiesen nach der Passage der Biogasanlage keine veränderten Resistenzen auf. Die Zoosaloral®-Impfstämme sind resistent gegen Spectinomy-cin, Erythromycin und Penicillin. / We investigated the natural inactivation of Salmonella in the stuff of a meso-philic biogas plant where cattle slurry, poultry waste and fat separator contents are fermented in a two-step process for the use of alternative energy recovery. From 1997 to 2000 we isolated 12 different Salmonella serovars (e. g. S. Enteriti-dis, S. Agona, S. Hadar) in the native sludge, in the fermenter material and in the fermentation product. The following parts of the samples were Salmonella-positive: cattle slurry 95,5% (n = 22), fermenter I 69,2% (n =13), fermenter II 50% (n = 20), storage tank 77,3% (n = 22), and fat separator 40% (n = 10). As source of the Salmonella we assume the slurry of the dairy cattle farm (esp. in the case of vaccine strains) and the fat separator contents. After an infection of cattle with S. Typhimurium in the sludge-producing farm and vaccination of calves with Zoosaloral® the vaccine strain (LT: DT009) was frequently found in the slurry. In the course of 13 tests we isolated the vaccine strain in 12 samples of the biogas plant slurry, in one sample of the fermenta-tion product and in 5 samples of the storage tank. In laboratory investigations we studied the inactivation of S. Typhimurium DT104 in fermented cattle slurry at storage temperatures of 7°C, 22°C, and 37°C. After a mean storage time of 10 days at 37°C (i.e. the working tempera-ture of the biogas plant) all Salmonella were inactivated. At 22°C they survived nine weeks, at 7°C more than 52 weeks. The microbiologic degradation causes the splitting of macromolecules and the formation of free volatile acides (VFA). After analysis of the VFA in cattle slurry and cosubstrates we tested different concentrations of formic, acetic, propionic, butyric, isobutyric, valerianic, and isovalerianic acid. In tests with the single acids and Salmonella concentrations higher than in native slurry an inactivation was achieved at acid concentrations between 10-40 mg/l. Because acid concen-trations in native sludge are lower, we examined an acid mixture with acid con-centrations equivalent to cattle slurry/cosubstrate at pH 7,3. In the mixture Salmonalla were daily reduced about 0,5 orders and inactivated in an average of 17 days. These data quantify the influence of VFA concentrations in slurry for the first time. We concluded that the increase and the influence of VFA are very important for the inactivation of S. Typhimurium DT104 during the 24-33 days of slurry fer-mentation in the biogas plant. After vaccination of calves with the live vaccine Zoosaloral® the excreted Salmonella vaccine strains could be distinguished after the passage of the biogas plant by their auxotrophy from wild strains. We rec-ommend the use of Bovisaloral-Diagnostikum® for investigations of slurry from cattle vaccinated with Salmonella live vaccine. The natural Salmonella serovars were resistant against numerous antibiotics. The Zoosaloral® vaccine strains showed no deviating resistances after passag-ing the biogas plant. The Zoosaloral® vaccine strains were spectinomycine-, erythromycine- and penicilline-resistent.