A convergência entre a biotecnologia e a nanotecnologia tem levado ao desenvolvimento de novos nanobiocompósitos híbridos com funções sinérgicas que incorporam as propriedades de reconhecimento dos biomateriais com as propriedades eletrônicas, ópticas e catalíticas únicas das nanopartículas. Apesar do recente desenvolvimento na síntese de nanobiocompósitos, a aplicação biomédica destes materiais ainda apresenta muitos desafios, já que não apenas uma conjugação apropriada é requerida, mas também outros importantes aspectos relacionados à biocompatibilidade. O presente trabalho tem como objetivo expandir o campo da síntese e caracterização de nanoparticulas funcionalizadas com biomoléculas. Em especial, visamos o entendimento e caracterização das interações entre nanopartículas de ouro (AuNPs) e proteínas, por meio do estudo de dois sistemas distintos: AuNPs funcionalizadas com Jacalina, e AuNPs funcionalizadas com a proteína BeCen1. No primeiro sistema, o interesse advém da capacidade da lectina Jacalina de reconhecer o dissacarídeo (Galβ1-3GalNAc) associado a tumores. Neste caso, AuNPs formadas na presença do dendrímero poli(amidoamina) geração 4.0 (PAMAM G4) foram conjugadas com a Jacalina marcada com o fluóroforo Isotiocianato de fluoresceína (FITC). A formação do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina foi confirmada por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM), Espalhamento de Luz Dinâmico (DLS), Espectroscopia de Absorção no UV-VIS e vibracional (FTIR). A interação entre as AuNP-PAMAM G4 e a Jacalina parece ser um processo dirigido por entropia com afinidade moderada e formação de complexo, segundo os resultados de Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) e supressão da fluorescência. Os resultados de Dicroísmo Circular (CD) mostraram que a conjugação da Jacalina com as AuNP-PAMAM G4 não alterou sua estrutura secundária. Testes realizados em cultura de células revelaram que o complexo apresenta maior afinidade e citotoxicidade pelas células de carcinoma do colo de útero humano (HeLa) se comparadas com fibroblastos saudáveis de adipócitos de camundongo (L929). Estes resultados são relevantes uma vez que demonstram o potencial do complexo AuNP-PAMAM G4/Jacalina-FTIR para aplicações biomédicas incluindo diagnóstico e tratamento de câncer. O segundo sistema é interessante devido a habilidade da proteína BeCen1 em formar filamentos nanométricos em função da temperatura. As AuNPs foram formadas na presença da proteína utilizando ácido fórmico diluído como agente redutor e o excesso de proteína foi separado por Cromatografia de Exclusão Molecular. Análises de CD revelaram uma pequena diminuição no conteúdo de α-hélices, confirmado por FTIR, o que pode estar relacionado à interação das AuNPs com os grupamentos amida desta proteína. Medidas de espalhamento de luz revelaram um aumento da turbidez da suspensão do complexo AuNP-BeCen1 com o aumento da temperatura e imagens de TEM, com e sem aquecimento, confirmaram uma mudança de padrão no arranjo das AuNPs. Estes resultados revelam a possibilidade de fabricação de nanobiocompósitos termorresponsivos, o que pode ser muito importante para aplicações em nanodispositivos. / The convergence between biotechnology and nanotechnology has led to the development of new hybrid nanocomposites that conjugate the bio-recognization properties of biomaterials and the unique electronic, optic and catalytic properties of the nanoparticles. Despite the recent advances in the development of nanobiocomposites, the biomedical applications of these materials are still limited, among other factors, by the low efficiency of functionalization and biocompatibility. The present study was aimed at developing proteinconjugated nanoparticles for application in nanomedicine. Our main focus were the understanding and characterization of the interactions between proteins and gold nanoparticles (AuNPs), which was accomplished using two distinct systems, viz.: Jacalin-functionalized AuNPs, and Becen1-functionalized AuNPs. In the former, the interest is due the capability of the protein Jacalin of recognize the disaccharide (Galβ1-3GalNAc), largely expressed in some tumors cells. AuNPs were synthesized in the presence of the polyamido amine generation 4.0 (PAMAM G4) and conjugated with a Jacalin target with the fluorescein isothiocyanate (FITC). The excess of protein was removed by centrifugation and the complex formation was confirmed by Transmission Electron Microscopy (TEM), Dynamic Light Scattering (DLS), UV-VIS Absorption and Vibrational Spectroscopy (FTIR). The interactions between AuNP-PAMAM G4 and Jacalin seemed to be driven by an entropic process with moderate affinity and complex formation, as revealed by Isothermal Titration Calorimetry (ITC) and quenching fluorescence measurements. Furthermore, Circular Dichroism (CD) analyses revealed that protein maintained its secondary structure upon conjugation with the nanoparticles. In vitro tests revealed that the AuNPs/Jacalin complexes presented higher affinity and cytotoxicity against human cervical cancer cell (HeLa) compared to healthy mouse fibroblasts (L929). These results are relevant, since the AuNP-PAMAM G4/Jacalin-FITC complex may be used for biomedical applications including cancer treatment and diagnostics. The second nanocomplex, comprising AuNPs and BeCen1, was chosen due to the ability of BeCen 1 to polymerize in the form of nanometric filaments as a function of temperature. The AuNPs were formed in the presence of the protein using diluted formic acid as reducing agent and the excess of protein was removed by Molecular Exclusion Chromatography. CD analysis showed a decrease in the -helix structures confirmed by FTIR, which may be related to the interaction between the AuNPs and the amide groups of the protein. Light scattering measurements revealed an increase in the turbidity of the dispersions upon increasing the temperature, indicating a change in the arrangement of the AuNPs. Such BeCen-1 induced alignment was confirmed by TEM images. The latter results point to the possibility of fabrication of novel thermoresponsive nanobiocomposites, which are of great relevance for nanodevices applications.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26042012-103048 |
| Date | 09 February 2012 |
| Creators | Marangoni, Valeria Spolon |
| Contributors | Zucolotto, Valtencir |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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