Nesse projeto trabalhamos com uma β-glicosidase digestiva da larva da lagarta Spodoptera frugiperda (Sfβgli50, 50 kD - AF052729), expressa na forma de proteína recombinante em E.colli. O nosso objetivo foi estudar o papel de dois resíduos de aminoácidos envolvidos na atividade catalítica da Sfβgli50. O primeiro resíduo estudado foi o Y456, envolvido na afinidade pela porção redutora do substrato (aglicone), o segundo resíduo foi o N329 envolvido na modulação do pH ótimo. Estudo do papel do resíduo Y456 na afinidade pelo aglicone do substrato. O sítio-ativo da Sfβgli50 é formado por quatros subsítios (-1, +1, +2, e +3). O subsítio que acomoda a porção não-redutora do substrato (glicone) recebe numeração negativa (-1), já os subsítios que acomodam a porção redutora do substrato (aglicone) recebem números positivos (+1, +2 e +3). Trabalhando com duas β-glicosidases de plantas (milho e sorgo), Cicek et al. (2000) demonstraram que uma pequena porção da extremidade C-terminal destas β-glicosidases (462SSGYTERF469 - numeração da enzima do sorgo) está envolvida na especificidade pelo aglicone do substrato, sendo que muitos desses aminoácidos são conservados em outras β-glicosidases da família 1. O alinhamento das sequências destas duas enzimas com a Sfβgli50 sugere que Y456 pode fazer parte do sítio de ligação do aglicone nesta β-glicosidase de inseto. Utilizando experimentos de mutação sítio-dirigida, o Y456 foi substituído por uma alanina (mutante Y456A) sendo que este foi expresso na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando o vetor pT7-7. O mutante Y456A foi parcialmente purificado através de uma cromatografia hidrofóbica em sistema de FPLC, e caracterizado utilizando diversos inibidores competitivos (glucono δ-lactona, celobiose, celotriose, pentilbglicosídeo e octilbtioglicosídeo). Comparando os Kis obtidos para a Sfβgli50 selvagem e mutante Y456A com os inibidores glucono δ-lactona, celobiose e celotriose, foi proposto que Y456 encontra-se no subsítio +1 do sítio ativo da Sfβgli50. Já através da comparação entre os inibidores octilβtioglicosídeo e pentilβglicosídeos constatou-se que Y456 interage com uma porção polar do aglicone do substrato, talvez através de uma ligação de hidrogênio. Baseando-se nestes Kis foi calculada a energia de associação de resíduos de glicose e grupos alquila nos subsítios +1 e +2, indicando que o subsítio +1 do mutante Y456A tem uma especificidade mais ampla frente à ligantes polares (glicose) e apolares (grupos butil) do que a enzima selvagem. Sabendo que este resultado foi obtido removendo-se um resíduo com um grupo polar na cadeia lateral (Y456), estes dados estão de acordo com a hipótese de que a especificidade dos subsítios da região de ligação do aglicone é determinada por um balanço entre resíduos polares e apolares (Marana et al., 2001). Estudo do papel do resíduo N329 na modulação do pH ótimo. O mecanismo de catálise da Sfβgli50 é dependente de dois resíduos de ácido glutâmico: um doador de prótons (E187 - pKa= 7,5) e um nucleófilo (E399 - pKa = 5,0). Sendo o pH ótimo da Sfβgli50 (6,2) uma média aritmética dos pKas destes dois resíduos catalíticos. Uma análise estrutural do sítio ativo da Sfβgli50 mostra que o resíduo N329 forma ligações de hidrogênio com o resíduo E187 (doador de prótons), talvez atuando na modulação do seu pKa. Para estudar o papel do resíduo N329 na atividade da Sfβgli50 foram construídos 3 mutantes, nos quais tal resíduo foi substituído por alanina (N329A), ácido aspártico (N329D) e uma glutamina (N329Q). Os mutantes foram expressos na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando os vetores pT7-7 e pCal-n-Flag. Entretanto, tentativas de purificação das SfΒgli50 mutantes através de cromatografia hidrofóbica foram infrutíferas, sugerindo uma possível inativação destas enzimas. Esta hipótese foi reforçada pela purificação das Sfβgli50 mutantes e selvagem contendo o peptídeo de fusão CBP (calmodulin binding peptide) através de cromatografia de afinidade. Este experimento demonstrou que as enzimas mutantes eram de fato inativas. Frente à estes resultados não foi possível concluir a caracterização do efeito do pH na atividade catalítica das Sfβgli50 mutantes N329A, N329D e N329Q. Por fim, foi proposto que a inativação da Sfβgli50 devido à mutações na posição N329 pode resultar de uma desnaturação das enzimas mutantes ou do reposicionamento do ácido catalítico devido à perda ou alteração da interação com o resíduo 329. / In this project it was studied the role of two residues (N329 and Y456) in the catalytic activity of a digestive β-glycosidase from Spodoptera frugiperda (SfΒgli50 - AF052729). N329 is believed to modulate the enzyme pH optimum, whereas Y456 may participate in the binding of the substrate aglycone. Role of Y456 The peptide 462SSGYTERF469 of the sorghum β-glycosidase is proposed to be part of the aglycone binding site in that enzyme. Some of those residues are conserved in Sfβgli50, among them Y456. Using site-directed mutagenesis Y456 was replaced by A and this mutant (Y456A) expressed in bacteria. Following that, this mutant enzyme was partially purified using hydrophobic chromatography. Inhibition experiments showed that binding of δ-gluconolactone, which occupies subsite -1, is not affected by that mutation. In contrast, Ki values for cellobiose (that binds to subsites -1 and +1) and cellotriose (that binds to subsites -1, +1 and +2) are two-fold higher than those of wild-type enzyme, indicating that mutation Y456A decrease the interaction with these oligocellodextrins. Moreover, binding of pentyl and octylβglucosides is not affected by mutation Y456A, suggesting that Y456 interacts with aglycone polar groups. Finally, evaluation of glucose and butyl binding energies in subsite +1 revealed that mutant Y456A specificity is broader than that of wild-type enzyme. Role of N329 A structural model of Sfβgli50 active site revealed that catalytic proton donor (E187) may interact with N329. In order to study the role of this interaction in the activity of Sfβgli50, N329 was replaced by A, D and Q (mutants N329A, N329D and N329Q, respectively). These mutants were expressed as recombinant proteins in bacteria and purified through affinity chromatography, revealing that Sfβgli50 was inactivated by those mutations. It was proposed that this inactivation may be due to protein desnaturation or a wrong positioning of the catalytic proton donor.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16022007-102333 |
| Date | 22 August 2005 |
| Creators | Padilha, Marcelo Henrique Peteres |
| Contributors | Marana, Sandro Roberto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo somente para a comunidade da Universidade de São Paulo. |
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