Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de β-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação β-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2ª molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um \"canal\" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, β-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sfβglu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tmβglu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sfβgly) e 56 kDa (Tmβgly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sfβgly) e 171% (Tmβgly) e a concentração protéica de 0,134 µg/µL (Sfβgly) e 0,217 µg/µL (Tmβgly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (vH/vT) foi analisada utilizando os substratos pNPβ-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MUβ-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tmβgly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas vH/vT depende da [S] variando de +∞ (vH>>vT) a 1,5 para pNPβ-gluco e +∞ a 1 para MUβ-gluco. Sfβgly, ao contrário, não transglicosila com substrato MUβ-gluco. Além disso, vH/vT para pNPβ-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sfβgly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MUβ-gluco, mas para pNPβ-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +∞ (vH>>vT) a 1,25. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (Km2) em Tmβgly e Sfβgly K201F do que em Sfβgly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNPβ-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a vglc menor do que de vpNP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol vH/vT diminui cerca de 7 vezes em Sfβgly e 2 vezes em Tmβgly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sfβgly são maiores do que para Tmβgly e Sfβgly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sfβgly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que vH/vT não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sfβgly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo. / Glycosides are essential to life and can be synthesized by enzymatic methods with high specificity. The reaction mechanism of GH1 β-glucosidases by double-substitution involves the formation of covalent intermediate (glycosyl-enzyme) which may follow two routes. One of them involves hydrolysis in β-glycosidic bond between aglycone glucone and the substrate, releasing a monosaccharide from the non-reducing end, whereas in the other route, transglycosylation or synthesis by kinetic control, the intermediate is attacked by a glucosyl acceptor (second substrate molecule), generating a new glucoside. BglB has two residues (W and H) that form a \"channel\" through which water attacks the covalent intermediate on the active site. Thus, the residues are potential targets for mutations that alter the balance between routes, increasing the efficiency of transglycosylation. To characterize the molecular basis of the ratio between these two catalytic routes, two β-glycosidases from GH1 family, Spodoptera frugiperda (Sfβgly; AF052729) and Tenebrio molitor (Tmβgly; AF312017) were produced as recombinant enzymes in Pichia pastoris GS115, concentrated using 90% (w/v) ammonium sulfate and reverse dialysis with PEG 10000, and dialyzed in 100 mM CP buffer pH 6. SDS-PAGE confirmed that Sfβgly (~50 kDa) and Tmβgly (~56 kDa) were pure after that procedure. The activity recovered after purification were 152% (Sfβgly) and 171% (Tmβgly) and protein concentration were 0.134 mg/mL (Sfβgly) and 0.217 mg/mL (Tmβgly). The ratio between the hydrolysis and transglycosylation (vH/vT) was analyzed using pNPβ-gluco substrates (0.1 mM to 8 mM) and MUβ-gluco (0.1 mM to 40 mM), the rate of formation of pNP or MU and glucose. Tmβgly catalyzes transglycosylation reactions with both substrates, but vH/vT depends on [S] ranging from +∞ (vH>>vT) to 1.5 for pNPβ-gluco and + ∞ to 1 for MUβ-gluco. In contrast, Sfβgly did not catalyses transglycosilation with MUβ-gluco. Moreover, vH/vT for pNPβ-gluco-is 2 and is independent of [S]. Sfβgly K201F combines properties of both, because it does not catalyse transglycosylation with MUβ-gluco, but for pNPβ-gluco the occurrence of transglycosylation is dependent on [S], ranging from + ∞ (vH>>vT) to 1.25. The kinetic parameters (Vmax e Km) were adjusted in Enzfitter and numerical simulation showing that Km2is higher for Tmβgly and Sfβgly K201F than Sfβgly. We also evaluated the effect of adding alternative acceptors that replace the water in pNPβ gluco-4 mM. For the three enzymes the addition of methanol makes vglc less than pNP, indicating the occurrence of transglycosylation. Addition of n-propanol decreases vH/vT about 7 times in Sfβgly and 2 times Tmβgly. The effects on Sfβgly are higher than on Tmβgly and Sfβgly K201F, suggesting easier access to the covalent intermediate in Sfβgly. We observe that vH/vT is not related to affinity for the second substrate molecule and may be modulated by mutation of residue K201 Sfβgly, position related to the access of water or alternative acceptor to the active site.

Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de β-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação β-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2ª molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um \"canal\" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, β-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sfβglu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tmβglu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sfβgly) e 56 kDa (Tmβgly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sfβgly) e 171% (Tmβgly) e a concentração protéica de 0,134 µg/µL (Sfβgly) e 0,217 µg/µL (Tmβgly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (vH/vT) foi analisada utilizando os substratos pNPβ-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MUβ-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tmβgly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas vH/vT depende da [S] variando de +∞ (vH>>vT) a 1,5 para pNPβ-gluco e +∞ a 1 para MUβ-gluco. Sfβgly, ao contrário, não transglicosila com substrato MUβ-gluco. Além disso, vH/vT para pNPβ-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sfβgly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MUβ-gluco, mas para pNPβ-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +∞ (vH>>vT) a 1,25. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (Km2) em Tmβgly e Sfβgly K201F do que em Sfβgly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNPβ-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a vglc menor do que de vpNP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol vH/vT diminui cerca de 7 vezes em Sfβgly e 2 vezes em Tmβgly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sfβgly são maiores do que para Tmβgly e Sfβgly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sfβgly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que vH/vT não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sfβgly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo. / Glycosides are essential to life and can be synthesized by enzymatic methods with high specificity. The reaction mechanism of GH1 β-glucosidases by double-substitution involves the formation of covalent intermediate (glycosyl-enzyme) which may follow two routes. One of them involves hydrolysis in β-glycosidic bond between aglycone glucone and the substrate, releasing a monosaccharide from the non-reducing end, whereas in the other route, transglycosylation or synthesis by kinetic control, the intermediate is attacked by a glucosyl acceptor (second substrate molecule), generating a new glucoside. BglB has two residues (W and H) that form a \"channel\" through which water attacks the covalent intermediate on the active site. Thus, the residues are potential targets for mutations that alter the balance between routes, increasing the efficiency of transglycosylation. To characterize the molecular basis of the ratio between these two catalytic routes, two β-glycosidases from GH1 family, Spodoptera frugiperda (Sfβgly; AF052729) and Tenebrio molitor (Tmβgly; AF312017) were produced as recombinant enzymes in Pichia pastoris GS115, concentrated using 90% (w/v) ammonium sulfate and reverse dialysis with PEG 10000, and dialyzed in 100 mM CP buffer pH 6. SDS-PAGE confirmed that Sfβgly (~50 kDa) and Tmβgly (~56 kDa) were pure after that procedure. The activity recovered after purification were 152% (Sfβgly) and 171% (Tmβgly) and protein concentration were 0.134 mg/mL (Sfβgly) and 0.217 mg/mL (Tmβgly). The ratio between the hydrolysis and transglycosylation (vH/vT) was analyzed using pNPβ-gluco substrates (0.1 mM to 8 mM) and MUβ-gluco (0.1 mM to 40 mM), the rate of formation of pNP or MU and glucose. Tmβgly catalyzes transglycosylation reactions with both substrates, but vH/vT depends on [S] ranging from +∞ (vH>>vT) to 1.5 for pNPβ-gluco and + ∞ to 1 for MUβ-gluco. In contrast, Sfβgly did not catalyses transglycosilation with MUβ-gluco. Moreover, vH/vT for pNPβ-gluco-is 2 and is independent of [S]. Sfβgly K201F combines properties of both, because it does not catalyse transglycosylation with MUβ-gluco, but for pNPβ-gluco the occurrence of transglycosylation is dependent on [S], ranging from + ∞ (vH>>vT) to 1.25. The kinetic parameters (Vmax e Km) were adjusted in Enzfitter and numerical simulation showing that Km2is higher for Tmβgly and Sfβgly K201F than Sfβgly. We also evaluated the effect of adding alternative acceptors that replace the water in pNPβ gluco-4 mM. For the three enzymes the addition of methanol makes vglc less than pNP, indicating the occurrence of transglycosylation. Addition of n-propanol decreases vH/vT about 7 times in Sfβgly and 2 times Tmβgly. The effects on Sfβgly are higher than on Tmβgly and Sfβgly K201F, suggesting easier access to the covalent intermediate in Sfβgly. We observe that vH/vT is not related to affinity for the second substrate molecule and may be modulated by mutation of residue K201 Sfβgly, position related to the access of water or alternative acceptor to the active site.

Nesse projeto trabalhamos com uma β-glicosidase digestiva da larva da lagarta Spodoptera frugiperda (Sfβgli50, 50 kD - AF052729), expressa na forma de proteína recombinante em E.colli. O nosso objetivo foi estudar o papel de dois resíduos de aminoácidos envolvidos na atividade catalítica da Sfβgli50. O primeiro resíduo estudado foi o Y456, envolvido na afinidade pela porção redutora do substrato (aglicone), o segundo resíduo foi o N329 envolvido na modulação do pH ótimo. Estudo do papel do resíduo Y456 na afinidade pelo aglicone do substrato. O sítio-ativo da Sfβgli50 é formado por quatros subsítios (-1, +1, +2, e +3). O subsítio que acomoda a porção não-redutora do substrato (glicone) recebe numeração negativa (-1), já os subsítios que acomodam a porção redutora do substrato (aglicone) recebem números positivos (+1, +2 e +3). Trabalhando com duas β-glicosidases de plantas (milho e sorgo), Cicek et al. (2000) demonstraram que uma pequena porção da extremidade C-terminal destas β-glicosidases (462SSGYTERF469 - numeração da enzima do sorgo) está envolvida na especificidade pelo aglicone do substrato, sendo que muitos desses aminoácidos são conservados em outras β-glicosidases da família 1. O alinhamento das sequências destas duas enzimas com a Sfβgli50 sugere que Y456 pode fazer parte do sítio de ligação do aglicone nesta β-glicosidase de inseto. Utilizando experimentos de mutação sítio-dirigida, o Y456 foi substituído por uma alanina (mutante Y456A) sendo que este foi expresso na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando o vetor pT7-7. O mutante Y456A foi parcialmente purificado através de uma cromatografia hidrofóbica em sistema de FPLC, e caracterizado utilizando diversos inibidores competitivos (glucono δ-lactona, celobiose, celotriose, pentilbglicosídeo e octilbtioglicosídeo). Comparando os Kis obtidos para a Sfβgli50 selvagem e mutante Y456A com os inibidores glucono δ-lactona, celobiose e celotriose, foi proposto que Y456 encontra-se no subsítio +1 do sítio ativo da Sfβgli50. Já através da comparação entre os inibidores octilβtioglicosídeo e pentilβglicosídeos constatou-se que Y456 interage com uma porção polar do aglicone do substrato, talvez através de uma ligação de hidrogênio. Baseando-se nestes Kis foi calculada a energia de associação de resíduos de glicose e grupos alquila nos subsítios +1 e +2, indicando que o subsítio +1 do mutante Y456A tem uma especificidade mais ampla frente à ligantes polares (glicose) e apolares (grupos butil) do que a enzima selvagem. Sabendo que este resultado foi obtido removendo-se um resíduo com um grupo polar na cadeia lateral (Y456), estes dados estão de acordo com a hipótese de que a especificidade dos subsítios da região de ligação do aglicone é determinada por um balanço entre resíduos polares e apolares (Marana et al., 2001). Estudo do papel do resíduo N329 na modulação do pH ótimo. O mecanismo de catálise da Sfβgli50 é dependente de dois resíduos de ácido glutâmico: um doador de prótons (E187 - pKa= 7,5) e um nucleófilo (E399 - pKa = 5,0). Sendo o pH ótimo da Sfβgli50 (6,2) uma média aritmética dos pKas destes dois resíduos catalíticos. Uma análise estrutural do sítio ativo da Sfβgli50 mostra que o resíduo N329 forma ligações de hidrogênio com o resíduo E187 (doador de prótons), talvez atuando na modulação do seu pKa. Para estudar o papel do resíduo N329 na atividade da Sfβgli50 foram construídos 3 mutantes, nos quais tal resíduo foi substituído por alanina (N329A), ácido aspártico (N329D) e uma glutamina (N329Q). Os mutantes foram expressos na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando os vetores pT7-7 e pCal-n-Flag. Entretanto, tentativas de purificação das SfΒgli50 mutantes através de cromatografia hidrofóbica foram infrutíferas, sugerindo uma possível inativação destas enzimas. Esta hipótese foi reforçada pela purificação das Sfβgli50 mutantes e selvagem contendo o peptídeo de fusão CBP (calmodulin binding peptide) através de cromatografia de afinidade. Este experimento demonstrou que as enzimas mutantes eram de fato inativas. Frente à estes resultados não foi possível concluir a caracterização do efeito do pH na atividade catalítica das Sfβgli50 mutantes N329A, N329D e N329Q. Por fim, foi proposto que a inativação da Sfβgli50 devido à mutações na posição N329 pode resultar de uma desnaturação das enzimas mutantes ou do reposicionamento do ácido catalítico devido à perda ou alteração da interação com o resíduo 329. / In this project it was studied the role of two residues (N329 and Y456) in the catalytic activity of a digestive β-glycosidase from Spodoptera frugiperda (SfΒgli50 - AF052729). N329 is believed to modulate the enzyme pH optimum, whereas Y456 may participate in the binding of the substrate aglycone. Role of Y456 The peptide 462SSGYTERF469 of the sorghum β-glycosidase is proposed to be part of the aglycone binding site in that enzyme. Some of those residues are conserved in Sfβgli50, among them Y456. Using site-directed mutagenesis Y456 was replaced by A and this mutant (Y456A) expressed in bacteria. Following that, this mutant enzyme was partially purified using hydrophobic chromatography. Inhibition experiments showed that binding of δ-gluconolactone, which occupies subsite -1, is not affected by that mutation. In contrast, Ki values for cellobiose (that binds to subsites -1 and +1) and cellotriose (that binds to subsites -1, +1 and +2) are two-fold higher than those of wild-type enzyme, indicating that mutation Y456A decrease the interaction with these oligocellodextrins. Moreover, binding of pentyl and octylβglucosides is not affected by mutation Y456A, suggesting that Y456 interacts with aglycone polar groups. Finally, evaluation of glucose and butyl binding energies in subsite +1 revealed that mutant Y456A specificity is broader than that of wild-type enzyme. Role of N329 A structural model of Sfβgli50 active site revealed that catalytic proton donor (E187) may interact with N329. In order to study the role of this interaction in the activity of Sfβgli50, N329 was replaced by A, D and Q (mutants N329A, N329D and N329Q, respectively). These mutants were expressed as recombinant proteins in bacteria and purified through affinity chromatography, revealing that Sfβgli50 was inactivated by those mutations. It was proposed that this inactivation may be due to protein desnaturation or a wrong positioning of the catalytic proton donor.

Nesse projeto trabalhamos com uma β-glicosidase digestiva da larva da lagarta Spodoptera frugiperda (Sfβgli50, 50 kD - AF052729), expressa na forma de proteína recombinante em E.colli. O nosso objetivo foi estudar o papel de dois resíduos de aminoácidos envolvidos na atividade catalítica da Sfβgli50. O primeiro resíduo estudado foi o Y456, envolvido na afinidade pela porção redutora do substrato (aglicone), o segundo resíduo foi o N329 envolvido na modulação do pH ótimo. Estudo do papel do resíduo Y456 na afinidade pelo aglicone do substrato. O sítio-ativo da Sfβgli50 é formado por quatros subsítios (-1, +1, +2, e +3). O subsítio que acomoda a porção não-redutora do substrato (glicone) recebe numeração negativa (-1), já os subsítios que acomodam a porção redutora do substrato (aglicone) recebem números positivos (+1, +2 e +3). Trabalhando com duas β-glicosidases de plantas (milho e sorgo), Cicek et al. (2000) demonstraram que uma pequena porção da extremidade C-terminal destas β-glicosidases (462SSGYTERF469 - numeração da enzima do sorgo) está envolvida na especificidade pelo aglicone do substrato, sendo que muitos desses aminoácidos são conservados em outras β-glicosidases da família 1. O alinhamento das sequências destas duas enzimas com a Sfβgli50 sugere que Y456 pode fazer parte do sítio de ligação do aglicone nesta β-glicosidase de inseto. Utilizando experimentos de mutação sítio-dirigida, o Y456 foi substituído por uma alanina (mutante Y456A) sendo que este foi expresso na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando o vetor pT7-7. O mutante Y456A foi parcialmente purificado através de uma cromatografia hidrofóbica em sistema de FPLC, e caracterizado utilizando diversos inibidores competitivos (glucono δ-lactona, celobiose, celotriose, pentilbglicosídeo e octilbtioglicosídeo). Comparando os Kis obtidos para a Sfβgli50 selvagem e mutante Y456A com os inibidores glucono δ-lactona, celobiose e celotriose, foi proposto que Y456 encontra-se no subsítio +1 do sítio ativo da Sfβgli50. Já através da comparação entre os inibidores octilβtioglicosídeo e pentilβglicosídeos constatou-se que Y456 interage com uma porção polar do aglicone do substrato, talvez através de uma ligação de hidrogênio. Baseando-se nestes Kis foi calculada a energia de associação de resíduos de glicose e grupos alquila nos subsítios +1 e +2, indicando que o subsítio +1 do mutante Y456A tem uma especificidade mais ampla frente à ligantes polares (glicose) e apolares (grupos butil) do que a enzima selvagem. Sabendo que este resultado foi obtido removendo-se um resíduo com um grupo polar na cadeia lateral (Y456), estes dados estão de acordo com a hipótese de que a especificidade dos subsítios da região de ligação do aglicone é determinada por um balanço entre resíduos polares e apolares (Marana et al., 2001). Estudo do papel do resíduo N329 na modulação do pH ótimo. O mecanismo de catálise da Sfβgli50 é dependente de dois resíduos de ácido glutâmico: um doador de prótons (E187 - pKa= 7,5) e um nucleófilo (E399 - pKa = 5,0). Sendo o pH ótimo da Sfβgli50 (6,2) uma média aritmética dos pKas destes dois resíduos catalíticos. Uma análise estrutural do sítio ativo da Sfβgli50 mostra que o resíduo N329 forma ligações de hidrogênio com o resíduo E187 (doador de prótons), talvez atuando na modulação do seu pKa. Para estudar o papel do resíduo N329 na atividade da Sfβgli50 foram construídos 3 mutantes, nos quais tal resíduo foi substituído por alanina (N329A), ácido aspártico (N329D) e uma glutamina (N329Q). Os mutantes foram expressos na forma de proteína recombinante em bactérias BL21 DE3 utilizando os vetores pT7-7 e pCal-n-Flag. Entretanto, tentativas de purificação das SfΒgli50 mutantes através de cromatografia hidrofóbica foram infrutíferas, sugerindo uma possível inativação destas enzimas. Esta hipótese foi reforçada pela purificação das Sfβgli50 mutantes e selvagem contendo o peptídeo de fusão CBP (calmodulin binding peptide) através de cromatografia de afinidade. Este experimento demonstrou que as enzimas mutantes eram de fato inativas. Frente à estes resultados não foi possível concluir a caracterização do efeito do pH na atividade catalítica das Sfβgli50 mutantes N329A, N329D e N329Q. Por fim, foi proposto que a inativação da Sfβgli50 devido à mutações na posição N329 pode resultar de uma desnaturação das enzimas mutantes ou do reposicionamento do ácido catalítico devido à perda ou alteração da interação com o resíduo 329. / In this project it was studied the role of two residues (N329 and Y456) in the catalytic activity of a digestive β-glycosidase from Spodoptera frugiperda (SfΒgli50 - AF052729). N329 is believed to modulate the enzyme pH optimum, whereas Y456 may participate in the binding of the substrate aglycone. Role of Y456 The peptide 462SSGYTERF469 of the sorghum β-glycosidase is proposed to be part of the aglycone binding site in that enzyme. Some of those residues are conserved in Sfβgli50, among them Y456. Using site-directed mutagenesis Y456 was replaced by A and this mutant (Y456A) expressed in bacteria. Following that, this mutant enzyme was partially purified using hydrophobic chromatography. Inhibition experiments showed that binding of δ-gluconolactone, which occupies subsite -1, is not affected by that mutation. In contrast, Ki values for cellobiose (that binds to subsites -1 and +1) and cellotriose (that binds to subsites -1, +1 and +2) are two-fold higher than those of wild-type enzyme, indicating that mutation Y456A decrease the interaction with these oligocellodextrins. Moreover, binding of pentyl and octylβglucosides is not affected by mutation Y456A, suggesting that Y456 interacts with aglycone polar groups. Finally, evaluation of glucose and butyl binding energies in subsite +1 revealed that mutant Y456A specificity is broader than that of wild-type enzyme. Role of N329 A structural model of Sfβgli50 active site revealed that catalytic proton donor (E187) may interact with N329. In order to study the role of this interaction in the activity of Sfβgli50, N329 was replaced by A, D and Q (mutants N329A, N329D and N329Q, respectively). These mutants were expressed as recombinant proteins in bacteria and purified through affinity chromatography, revealing that Sfβgli50 was inactivated by those mutations. It was proposed that this inactivation may be due to protein desnaturation or a wrong positioning of the catalytic proton donor.

β-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma β-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sfβgli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das β-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES‡ e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sfβgli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sfβgli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sfβgli50 mutantes. Estas 46 Sfβgli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sfβgli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The β-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a β-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sfβgli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor β-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES‡. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sfβgli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sfβgli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sfβgli50 were constructed. These 46 Sfβgli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sfβgli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.

β-glicosidases da família 1 das glicosídeo hidrolases (GH 1) são um dos mais importantes grupos de enzimas, estando envolvidas em diversos processos biológicos. Neste trabalho o objetivo principal foi o estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato em β-glicosidases GH 1 utilizando como modelo experimental uma β-glicosidase pertencente a larva de Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Na primeira etapa procurou-se analisar através de mutagênese sítio-dirigida e cinética enzimática o papel na modulação da especificidade pelo substrato e na catálise dos resíduos E190, E194, K201 e M453 da Sfβgli50 , os quais correspondem aos encontrados no sítio de ligação do aglicone das β-glicosidases de milho e de sorgo. Os resultados mostraram que E190 favorece a ligação da porção inicial de aglicones do tipo alquil inicial e também da primeira unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos. E194 favorece a ligação de radicais alquil, enquanto K201 é mais relevante para a ligação de unidades de glicose em detrimento de radicais alquil. O balanço entre as interações com E194 e K201 determina a preferência entre unidades de glicose versus radicais alquil. M453 favorece a ligação da segunda unidade de glicose de aglicones oligossacarídicos e também da porção inicial de aglicones do tipo alquil. Nenhum destes resíduos interage com a porção terminal de aglicones do tipo alquil. Demonstrou-se que todos estes resíduos contribuem de forma similar e individualmente fraca na estabilização do complexo ES‡ e suas interações com o aglicone não influenciam na ligação do glicone. Na segunda etapa, procurou-se identificar resíduos ou regiões da Sfβgli50 que participem do processo de modulação da especificidade pelo substrato e que ainda não tivessem sido descritos na literatura. Assim, selecionou-se 14 Sfβgli50 mutantes a partir de uma \"biblioteca\" de mutantes geradas por mutagênese aleatória in vivo. As análises de \"contatos\" e de ligações de hidrogênio envolvendo estes resíduos mutados possibilitaram a identificação de outros resíduos e, consequentemente, a construção de mais 32 Sfβgli50 mutantes. Estas 46 Sfβgli50 mutantes foram produzidas em sistema heterólogo de expressão em bactéria, purificadas e caracterizadas cineticamente. A análise dos resultados obtidos sugere que alguns resíduos mutados devem participar da modulação da especificidade pelo substrato formando \"vias de conexão\", de tal forma que mutações em resíduos que compõem uma \"via\" podem ter efeitos propagados através de suas conexões e, assim, atingirem outras porções da Sfβgli50, como o sítio ativo. Esta propagação pode se dar através de alterações no posicionamento espacial e no conjunto das interações não-covalentes entre os resíduos envolvidos. Finalmente um ponto em comum aos efeitos mutacionais analisados parece ser uma alteração na plataforma basal do glicone, W444, o que causaria modificações na preferência relativa pelos substratos fucosídeos e glucosídeos. / The β-glycosidases of family 1 of the glycoside hydrolases (GH 1) are one of the most important groups of enzymes. These enzymes are involved in a high diversity of physiological functions. The main objective of this study was the analysis of the molecular bases of the specificity for substrate of a β-glycosidase from the larvae of Spodoptera frugiperda (Sfβgli50). Initially the role of residues E190, E194, K201 and M453 of Sfβgli50 in modulation of the specificity for the substrate was investigated through site-directed mutagenesis experiments and enzyme kinetic analysis. These residues corresponds to the those found in the aglycone binding site of Zea mays and Sorghum bicolor β-glycosidases. The results showed that E190 favors the binding of the initial portion of alkyl-type aglycones (up to the sixth methylene group) and also the first glucose unit of oligosaccharidic aglycones, whereas a balance between interactions with E194 and K201 determines the preference for glucose units versus alkyl moieties. E194 favors the binding of alkyl moieties, while K201 is more relevant for the binding of glucose units, in detriment of its favorable interaction with alkyl moieties. In addition, M453 favors the binding of the second glucose unit of oligosaccharidic aglycones and also of the initial portion of alkyl-type aglycones. None of these residues interact with the terminal portion of alkyl-type aglycones. It was also demonstrated that E190, E194, K201 and M453 similarly contribute to stabilize ES‡. Their interactions with aglycone are individually weaker than those formed by residues interacting with glycone, but their joint catalytic effects are similar. Finally, these interactions with aglycone do not influence glycone binding. In the second part of this study, new Sfβgli50 residues or portions that participated in the modulation of the substrate specificity were identified. In order to reach this objective, 14 Sfβgli50 mutants were seleted from a \"library\" generated by random mutagenesis in vivo. Based on the \"contacts\" or hydrogen bounds involving these 14 mutated residues 32 additional mutant Sfβgli50 were constructed. These 46 Sfβgli50 mutant were produced in bacteria, purificated and characterized. The results suggest that these residues ways be grouped in \"connective pathways\", a set of residues that contact each other. Mutations in residues that compose a \"pathways\" may be propagated through its connections reaching the Sfβgli50 active site. This propagation may be mediated by alterations in the spatial positioning and the set of non covalent interactions of these residues. Finally, several of these \"connective pathways\" contact a common point in the active site, the basal platform of the glycone subsite, W444.

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