El
present
treball
es
centra
en
l’estudi
de
la
producció
de
proteïnes
recombinants
en
línies
cel·∙lulars
de
mamífer.
Concretament,
s’ha
realitzat
l’estudi
de
tres
estratègies
de
bioprocés,
totes
elles
basades
en
el
cultiu
de
cèl·∙lules
HEK293.
Com
a
proteïna
model
per
a
l’expressió
de
proteïnes
heteròlogues
s’ha
triat
la
proteïna
CapPCV2,
la
qual
conforma
la
càpsida
viral
del
Circovirus
porcí
serotip
2
(PCV2).
Aquest
virus
és
l’agent
causal
de
PCVDS
(porcine
circovirus
diseases
o
malaties
derivades
de
circovirus
porcí).
Aquest
terme
engloba
un
conjunt
de
malalties
i
síndromes
que
tenen
un
elevat
impacte
econòmic
en
la
indústria
porcina.
El
projecte
s’ha
enfocat
des
de
la
perspectiva
de
desenvolupament
i
optimització
del
bioprocés
i,
en
conseqüència,
l’increment
de
la
producció
volumètrica
ha
estat
la
força
impulsora
de
tot
el
treball.
En
primer
lloc
es
presenten
els
estudis
per
a
la
selecció
del
medi
de
cultiu
i
suplements
nutricionals.
El
creixement
cel·∙lular
depèn
en
gran
mesura
de
les
característiques
nutricionals
i
fisicoquímiques
del
medi
en
que
se
les
cultiva.
Per
tant,
trobar
el
medi
adequat
és
un
dels
factors
clau
per
a
l’expansió
del
cultiu
cel·∙lular.
L’estudi
inicial
de
medis
de
cultiu
va
permetre
augmentar
sis
vegades
la
densitat
de
cèl·∙lules
viables
en
comparació
al
medi
original
en
que
es
cultivaven.
D’altra
banda,
s’han
explorat
diferents
estratègies
de
cultiu,
i
com
a
resultat
s’ha
implementat
una
estratègia
de
fed-‐batch
que
ha
permès
arribar
a
densitats
cel·∙lulars
de
26.8x106
cell/mL.
En
el
segon
i
tercer
capítol
de
resultats,
s’avaluen
tres
estratègies
diferents
per
a
la
producció
de
la
proteïna
recombinant
CapPCV2
(r-‐CapPCV2).
La
primera
estratègia
ha
estat
la
infecció
de
cèl·∙lules
HEK293
amb
un
vector
adenoviral
que
codifica
el
gen
de
la
CapPCV2
(vector
generat
dins
del
treball
d’aquesta
tesis
doctoral).
Els
paràmetres
d’infecció
s’han
estudiat
en
profunditat
per
tal
de
trobar
els
paràmetres
d’infecció
(medi
de
cultiu,
MOI
(multiplicitat
d’infecció),
TOI
(temps
d’infecció)
i
TOH
(temps
de
recollida))
per
a
la
millora
de
la
producció
de
la
proteïna
i
el
vector
adenoviral.
La
segona
i
tercera
estratègia
estan
basades
en
la
generació
de
línies
cel·∙lulars
estables.
Concretament,
s’ha
generat
una
línia
cel·∙lular
productora
de
r-‐CapPCV2
a
partir
de
la
integració
a
l’atzar
del
vector
plasmídic
en
el
genoma
de
la
cèl·∙lula.
D’altra
banda,
s’han
generat
línies
cel·∙lulars
amb
la
integració
dirigida
del
gen
en
llocs
prèviament
caracteritzats
com
d’altra
transcripció
genètica.
La
integració
dirigida
s’ha efectuat
mitjançant
la
tecnologia
RMCE
(recombinant
mediated
cassette
exchange,
o
bescanvi
de
casset
mitjançada
per
recombinació).
Després
de
la
comparació
de
les
productivitats
específiques
i
volumètriques
aconseguides
amb
cada
estratègia,
el
millor
productor
va
ser
seleccionat.
Nogensmenys,
r-‐CapPCV2
es
produeix
en
quantitats
molt
baixes
i
per
tant
no
ha
sigut
possible
dissenyar
un
procés
de
producció
rentable
i
altres
alternatives
de
producció
s’haurien
d’estudiar
en
un
futur.
Finalment,
l’estudi
d’un
comportament
metabòlic
particular
observat
en
les
cèl.lules
en
cultiu
s’ha
adreçat
des
d’una
perspectiva
fisiològica
i
metabòlica.
A
certes
condicions
extracel·∙lulars,
s’ha
observat
que
les
cèl·∙lules
HEK293
poden
consumir
de
manera
simultània
glucosa
i
lactat
durant
el
seu
creixement
exponencial.
Després
d’un
ampli
estudi
d’aquestes
condicions,
s’ha
determinat
que
el
canvi
de
la
producció
d’àcid
làctic
(que
és
el
principal
problema
dels
cultius
d’alta
densitat
de
cèl·∙lules
de
mamífer)
cap
al
consum
d’aquest
metabòlit
pot
ser
generat
des
de
el
començament
del
cultiu
quan
el
pH
és
de
6.6
i
la
concentració
de
lactat
és
de
4-‐8mM.
En
aquestes
condicions,
ni
el
creixement
cel·∙lular
ni
la
producció
de
proteïna
es
veuen
afectades
negativament.
A
la
llum
d’aquests
resultats,
es
genera
la
hipòtesi
de
que
les
cèl·∙lules
HEK293
poden
co-‐transportar
el
lactat
extracel.lular
i
els
protons
com
un
mecanisme
de
detoxificació
del
pH.
D’altra
banda,
l’aplicació
de
l’anàlisi
de
balanç
de
fluxos
(FBA)
ha
revelat
que
quan
la
glucosa
i
el
lactat
es
consumeixen
simultàniament
s’aconsegueix
un
metabolisme
“equilibrat”,
és
a
dir
els
fluxos
de
la
glicòlisi
i
el
cicle
TCA
esdevenen
similars,
evitant
l’acumulació
de
piruvat
en
el
citosol,
la
seva
transformació
a
làctic
i
finalment
la
secreció
d’aquest
metabòlit.
Aquest
comportament
és
totalment
oposat
al
que
s’observa
de
forma
general
en
els
cultius
de
cèl.lules
de
mamífer
en
creixement
exponencial,
on
els
elevats
fluxos
de
la
glicòlisi
troben
una
limitació
en
els
fluxos
d’entrada
a
la
mitocòndria
(és
a
dir,
del
cicle
TCA)
i
conseqüentment
el
lactat
és
produït
i
secretat
al
medi.
La
construcció
d’un
model
metabòlic
i
l’aplicació
de
FBA
permetrà
fer
prediccions
in
silico
de
comportaments
metabòlics
causats
per
la
sobreexpressió
o
el
silenciament
de
gens
diana.
Aquesta
estratègia
obre
la
possibilitat
de
generar
línies
cel·∙lulars
que
presentin
un
metabolisme
optimitzat
per
tal
d’estudiar
estratègies
de
cultiu
més
eficients
per
a
l’increment
de
la
densitat
cel·∙lular
i
productivitat
de
proteïna
recombinant. / The
thesis
is
focused
on
the
study
of
recombinant
protein
production
in
mammalian
cell
lines.
In
particular,
the
study
of
three
different
approaches
of
different
bioprocesses
based
on
HEK293
cells
has
been
addressed.
As
a
model
protein
for
recombinant
expression,
CapPCV2
has
been
selected.
This
protein
makes
up
the
viral
capsid
of
Porcine
circovirus
serotype
2
(PCV2),
which
is
the
causative
agent
of
PCVDs
(porcine
circovirus
diseases),
a
group
of
diseases
with
major
impact
in
pig’s
industry
worldwide.
This
project
has
been
addressed
from
the
perspective
of
bioprocess
development
and
optimization
and
therefore,
the
increment
of
volumetric
production
of
cells,
virus
and
proteins
have
been
the
driving
force
of
the
research.
Firstly,
cell
culture
media
and
nutritional
supplementation
studies
are
presented.
Cell
growth
relies
in
high
extent
to
the
nutritional
and
physicochemical
characteristics
of
the
media
in
which
cells
are
cultured
and
therefore,
finding
the
proper
cell
media
is
one
of
the
key
factors
for
cell
culture
expansion.
The
initial
media
study
resulted
in
a
6-‐fold
increment
of
the
maximal
viable
cell
achieved
in
the
original
media.
Besides,
different
cell
culture
strategies
have
been
explored,
which
resulted
in
a
fed-‐batch
strategy
that
allowed
reaching
maximal
viable
cell
densities
of
26.8x106
cell/mL,
which
represents
13-‐fold
increment
on
maximal
viable
cell
density
originally
reached.
In
the
second
and
third
chapter
of
results,
three
different
approaches
for
the
expression
of
recombinant
CapPCV2
(r-‐CapPCV2)
are
evaluated
and
discussed.
As
a
first
approach,
a
viral
recombinant
adenovirus
encoding
for
the
gene
CapPCV2
has
been
generated
and
used
as
viral
vector
for
the
production
of
the
recombinant
protein
in
HEK293
cells.
Besides,
a
deep
study
of
the
main
parameters
that
affect
the
infection
performance
has
been
carried
out
and
discussed
in
order
to
find
the
best
media,
MOI
(multiplicity
of
infection),
TOI
(time
of
infection)
and
TOH
(time
of
harvest)
for
adenovirus
and
recombinant
protein
production.
This
study
was
performed
with
an
adenovirus
expressing
the
reporter
gene
GFP
and
thereafter,
the
best
infection
parameters
encountered
were
applied
for
the
production
of
r-‐CapPCV2
(media:
SFMTransFx-‐293
supplemented
with
4mM
glutaMAX,
5%
FBS
and
10%CB5;
MOI:1;
TOI:1x106
cell/mL)
and
TOH:48hpi).
The
second
and
third
strategies
are
both
based
on
the
generation
of
stable
producer
cell
lines,
but
one
strategy
relies
on
illegitimate
(or
random)
integration
of
the
gene
in
the
HEK293
genome
,whereas
the
other
strategy
is
a
site-‐directed
integration
of
the gene
in
previously
characterized
hot-‐spots
(i.e.
high-‐active
transcribed
regions
from
genome).
The
site-‐directed
integration
was
performed
using
RMCE
technology
(Recombinant
mediated
cassette
exchange).
After
the
comparison
of
the
specific
and
volumetric
productivities
achieved
with
each
approach,
the
best
producer
has
been
selected.
Nevertheless,
r-‐CapPCV2
was
poorly
produced
so
it
was
unfeasible
to
develop/design
a
cost-‐effective
industrial
bioprocess
and
other
alternatives
must
be
studied
in
the
future.
Finally,
the
study
of
an
unexpected
metabolic
behaviour
observed
in
HEK293
cells
cultured
in
our
lab
has
been
addressed
from
a
physiologic
and
metabolic
perspective.
HEK293
cells
could
concomitantly
consume
glucose
and
lactate
in
exponentially
growing
cultures
at
particular
environmental
conditions.
After
a
deep
study
of
these
conditions,
it
was
found
out
that
the
switch
from
lactate
secretion
(which
is
the
main
drawback
of
mammalian
high
cell
density
cultures)
to
lactate
consumption
can
be
triggered
from
the
beginning
of
cell
culture
at
pH0=6.6
together
with
the
addition
of
4-‐12mM
of
lactate
to
media.
Remarkably,
under
these
conditions
nor
cell
growth
neither
protein
production
were
negatively
affected.
Form
these
results,
we
hypothesize
that
HEK293
can
co-‐transport
lactate
and
H+
to
the
cytosol
as
a
pH-‐detoxification
mechanism.
Moreover,
the
application
of
flux
balance
analysis
permitted
to
find
out
that
when
lactate
and
glucose
are
consumed
together
a
“more
balanced”
metabolism
is
achieved,
meaning
that
glycolytic
and
TCA
fluxes
became
similar,
avoiding
pyruvate
accumulation
at
the
cytosol
and
consequently,
lactate
formation.
This
is
totally
opposed
to
the
extensively
observed
metabolism
of
exponentially
growing
mammalian
cell
lines,
where
the
high
flux
through
the
glycolytic
pathway
encounters
a
limitation
on
the
fluxes
entering
the
mitochondria
(hence,
the
TCA
cycle)
and
consequently
lactate
is
produced
and
secreted
to
media.
The
construction
of
a
HEK293
metabolic
model
and
the
application
of
FBA
will
allow
making
in
silico
predictions
of
metabolic
beahaviours
after
the
upregulation
or
downregulation
of
target
genes.
This
strategy
may
open
the
possibility
of
generate
engineered
HEK293
cell
lines
with
an
optimised
metabolism
in
order
to
study
more
efficient
cell
culture
strategies
towards
the
achievement
of
higher
cell
densities
and
product
titres.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/308324 |
| Date | 21 July 2015 |
| Creators | Liste Calleja, Leticia |
| Contributors | Cairó i Badillo, Jordi Joan, Lecina i Veciana, Martí, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 319 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0037 seconds