Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Prostate cancer (PCa) is the second most common cancer in men after lung cancer. Around 1.1 million men worldwide were diagnosed with PCa in 2012. PCa depends essentially on androgen stimulation for growth and cell survival. The androgen receptor (AR) is a nuclear hormone receptor that is activated by androgenic hormones and the protein through which the physiological effects of androgens are mediated. The AR is necessary for normal prostate development, growth and physiology but also has an important role in the progression of PCa. It is an essential regulator of tumor growth, spread and survival of cancer cells in castration-resistant prostate cancer (CRPC), a stage of the disease that has become resistant to the current therapies, and thus represents a potential therapeutic target.
The AR is composed of four domains: the N-terminal domain (NTD), which is thought to be intrinsically disordered, the DNA-binding domain (DBD) containing two zinc fingers, the hinge region and the ligand-binding domain (LBD) that binds both testosterone and dihydrotestosterone (DHT). The AR NTD plays a crucial role in the constitutive activity of the AR in tumors from patients with castration resistance. Currently, there is no effective treatment for CRPC. The transactivation by the NTD is independent on androgens and therefore circumvents the two current therapeutic strategies that directly target the androgen signaling axis and aim to prevent binding of androgens to the AR LBD. For this reason, we have characterized the conformational properties of the intrinsically disordered NTD, and in particular the activation function 1 (AF1) region, which contains transactivation units Tau-1 and Tau-5 important for AR transactivation. Due to the intrinsically disordered nature of these regions, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy has been used to assign the protein backbone of AF1* (AR 142-448) and to describe its secondary structure and dynamic characteristics. We found that, in vitro, AF1* has a low tendency to self-associate into a dimer. In addition, regions of AF1* with higher secondary structure propensity and less flexibility are also involved in dimerization of AF1* and coincide with regions previously identified to be functional (core Tau-1 and Tau-5).
In this thesis, the role of the AR NTD in transcriptional activation was also investigated at the molecular level. We have studied its interaction with RAP74, a subunit of the general transcription factor IIF (TFIIF). Interaction of the 433WHTLF437 motif of AR, located within the Tau-5 region, with RAP74 enables transactivation in CRPC cells. This novel mechanism could explain aberrant transactivation in cells of castration-resistant patients. Our data suggest that phosphorylation of residues N-terminal to the motif may be necessary for this interaction to occur.
Finally, we wished to understand how the AR NTD can be targeted by small molecules. We have studied the mechanism of interaction of EPI-001, a small molecule that has recently been described as a potent inhibitor of AR interacting with the NTD of AR and causing the regression of CRPC. The results showed a specific recognition mechanism by which EPI-001 interacts with a low populated conformation of Tau-5, a conformation that is possibly related to the dimeric state of AF1. / El cáncer de próstata (PCa) es el segundo tipo de cáncer más común en hombres después del cáncer de pulmón. Alrededor de 1.1 millones de hombres en todo el mundo se les diagnosticó PCa durante el año 2012. El cáncer de próstata depende esencialmente de la estimulación de los andrógenos para el crecimiento y la supervivencia celular. El receptor androgénico (AR) es un receptor de hormonas nuclear que es activado por las hormonas andrógenas y la proteína mediante la cual los efectos fisiológicos de los andrógenos se producen. El AR es necesario para el desarrollo normal de la próstata, su crecimiento y fisiología pero también tiene un papel muy importante en la progresión del cáncer de próstata. Por ello, es un regulador esencial para el crecimiento, diseminación y supervivencia de células cancerígenas en tumores de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), y por tanto, representa una potencial diana terapéutica.
Desde el punto de vista estructural y functional, el AR está compuesto por cuatro dominios: el dominio N-terminal (NTD) que se piensa que es intrínsicamente desordenado, el dominio de unión a DNA (DBD) que contiene dos dedos de zinc, la región bisagra y el dominio de unión de ligando (LBD) que une tanto testosterona como dihidro-testosterona (DHT). El NTD de AR juega un papel crucial en la actividad constitutiva del AR en tumores de pacientes con resistencia a la castración, el cancer de prostata más avanzado. Actualmente no existe un tratamiento efectivo para CRPC. La transactivación del NTD es independiente de los andrógenos y por tanto evita las estrategias actuales de tratamiento dirigidos al eje de señalización de andrógenos. Por esta razón, se ha realizado la caracterización de las propiedades conformacionales del NTD intrínsecamente desordenado del AR y en particular del AF1, la región más potente para la activación del AR que contiene los regiones Tau-1 y Tau-5. Debido a la naturaleza intrínsecamente desordenada de estos regiones, se ha realizado la caracterización por resonancia magnética nuclear (NMR) midiendo los parámetros de NMR que permiten la asignación del esqueleto proteico de AF1 que permiten describir sus características dinámicas y de estructura secundaria. Hemos encontrado que, in vitro, AF1* (AR 142-448) posee una tendencia reducida pero notable a asociarse a sí misma formando un estado dimérico. Además, las regiones de AF1* con una tendencia mayor de estructura secundaria y menor flexibilidad también están involucradas en la dimerización de AF1* y coinciden con las regiones que fueron previamente identificadas como funcionales (regiones centrales de Tau-1 y Tau-5).
En esa tesis también se ha investigado el papel del NTD del AR en la activación transcripcional a nivel molecular. Se ha estudiado su interacción con RAP74, una subunidad del factor de transcripción general IIF (TFIIF). La interacción del motivo 433WHTLF437 de AR, localizado en la región Tau-5, permite la transactivación por unión con RAP74 en células CRPC. Este novedoso mecanismo podría explicar la transactivación incorrecta en células de pacientes resistentes a la castración. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de residuos en el lado N-terminal del motivo puede ser necesario para que se produzca esta interacción.
Por último, se ha buscado una explicación de cómo los compuestos actuales que interaccionan con el AR se unen al NTD. Para ello hemos probado a estudiar el mecanismo de interacción de EPI-001, una molécula pequeña que recientemente se ha descrito como un potente inhibidor de AR que interacciona con el dominio NTD de AR y produce la regresión del proceso cancerígeno durante el estado más avanzado. Los resultados obtenidos muestran un mecanismo de reconocimiento específico por el cual EPI-001 interacciona con una conformación poco poblada de Tau-5, conformación que posiblemente esté relacionada con el estado dimérico de AF1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/147275 |
| Date | 26 June 2014 |
| Creators | De Mol, Eva |
| Contributors | Salvatella i Giralt, Xavier, Salvatella i Giralt, Xavier, Universitat de Barcelona. Facultat de Farmàcia |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 419 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds