Una de las aplicaciones de la ingeniería de proteínas es el desarrollo de biosensores moleculares como herramientas para la detección de sustancias mediante la interacción de una macromolécula y su ligando. De acuerdo a este principio se han generado una serie de prototipos de biosensores enzimáticos que han surgido a partir de la ingeniería de proteínas tales como la fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, b-lactamasa y la proteína TSP del bacteriófago P22. En todas estas enzimas modificadas se han insertado péptidos inmunoreactivos que actúan como sondas, en aquellos sitios permisivos de las superficies expuestas al solvente de cada enzima. La unión con anticuerpos anti-péptido da como resultado un aumento o una disminución en la actividad enzimática en una forma dependiente del título, lo que a su vez constituye un método simple para la detección y cuantificación de especies moleculares dentro de una mezcla compleja.Hasta el momento los únicos activadores descritos de los biosensores basados en enzimas son los anticuerpos y aún se desconoce el mecanismo por el cual se produce esta regulación enzimática. El principal objetivo de este trabajo ha sido determinar el tipo de interacciones moleculares que son necesarias para que se lleve a cabo la modulación de la actividad b-galactosidasa. Especialmente, se pretendía evaluar la necesidad de una unión bivalente para la reactivación y explorar la adaptación de los biosensores b-galactosidasa a la detección de ligandos monovalentes, como antígenos.Se evaluó la interacción molecular entre un péptido RGD recombinante del virus de la fiebre aftosa, expuesto en la superficie de una proteína portadora y sus receptores en la superficie celular. Como ligandos se utilizaron las integrinas avb3 y a5b1 solubles, así como células BHK21. Los resultados indicaron que ni las integrinas solubles ni aquellas expuestas en las células son capaces de modificar la actividad de sensores enzimáticos que por el contrario son activados por la unión de anticuerpos dirigidos contra el motivo RGD. Adicionalmente, se realizaron otros ensayos para determinar el impacto que podía tener la presentación múltiple de péptidos sobre la eficiencia de la unión a células. En este caso se observó que aumentando el número de segmentos virales mejoraba la unión de las proteínas recombinantes a las células.Se llevó a cabo el clonaje y producción en Escherichia coli de un fragmento scFv recombinante del anticuerpo monoclonal SD6, dirigido contra un péptido vírico antigénico, expuesto en un modelo de biosensor basado en la enzima b-galactosidasa. Los resultados indicaron que la unión del scFv no causaba ninguna respuesta enzimática mientras que la presencia simultánea del scFv y del fragmento Fab del SD6 daba como resultado una respuesta eficiente pero no aditiva del sensor, cuya actividad enzimática aumentaba hasta en un 200%. Este efecto cooperativo que también se pudo observar cuando se combinaban el scFv y el fragmento Fab de un anticuerpo no homólogo denominado 4C4, nos permitió postular que la reactivación enzimática requiere contactos múltiples y probablemente heterogéneos entre el sensor molecular y los analitos, y que no es necesaria la interacción con ligandos moleculares bivalentes para que se produzca dicha modulación de actividad.Por último, se evaluaron diferentes sitios tolerantes de la enzima b-galactosidasa para generar enzimas híbridas funcionales que presentaran el fragmento recombinante scFv del anticuerpo monoclonal SD6. La caracterización de las proteínas híbridas obtenidas indicó que al fusionar dicho fragmento al extremo amino-terminal de la enzima, la proteína era estable, mantenía su actividad específica e interactuaba con el antígeno hacia el cual estaba dirigido el fragmento de anticuerpo fusionado. Además la quimera scFv-enzima era activa aún cuando se encontraba unida al antígeno y por lo tanto, se demostró su utilidad como reactivo en ELISA. / One of the applications of protein engineering is the development of molecular biosensors as tools for the detection of substances by means of the interaction between a macromolecule and its ligand. According to this principle, a series of prototypes of enzymatic biosensors have been generated through the engineering of proteins such as alkaline phosphatase, b-galactosidase, b-lactamase and TSP protein from P22 bacteriophage. In all these modified enzymes, immunoreactive peptides acting as probes have been inserted in those permissive sites of solvent-exposed surfaces of each enzyme. Binding with anti-peptide antibodies gives rise to an increase or a decrease in the enzymatic activity in a titre dependent way, what in turn constitutes a simple method for the detection and quantification of molecular species within a complex mixture. Until now, antibodies are the only described activators of enzyme based biosensors and the mechanism by which this enzymatic regulation takes place is still unknown. The main objective of this work was to determine the type of molecular interactions necessary for the up-regulation of b-galactosidase activity. Specially, it was sought to evaluate the need of a bivalent union for activity modulation and to explore the adaptation of b-galactosidase biosensors to the detection of monovalent ligands, as antigens. The molecular interaction between a recombinant RGD peptide from foot-and-mouth disease virus displayed on the surface of a carrier protein and its receptors on the cell surface was evaluated. Soluble integrins avb3 and a5b1, as well as BHK21 cells were used. The results indicated that both soluble integrins and cell linked ones were not able to modify the activity of enzymatic sensors that on the contrary are activated by binding of antibodies directed against the RGD motif. Additionally, other assays were carried out to determine the impact that multiple peptide presentation could have on cell-binding efficiency. In this case it was observed that increasing the number of viral segments cell binding to recombinant proteins was improved.Cloning and production in Escherichia coli of a recombinant SD6 scFv fragment directed against a sensing peptide, displayed on a model b-galactosidase-based biosensor was carried out. The results indicated that scFv-binding did not cause any enzymatic response while the simultaneous presence of scFv and the SD6 Fab fragment results in a non-additive, efficient sensor response, enhancing the enzyme activity up to about 200%. This cooperative effect, which also could be observed by combining SD6 scFv and the non-homologous anti-peptide 4C4 Fab fragment, allowed us to postulate that enzyme up-regulation requires multiple and probably heterogeneous contacts between the sensor molecule and the analytes, and that interaction with bivalent molecular ligands is not necessary for activity modulation to take place. Lastly, different permissive sites in b-galactosidase enzyme were evaluated to generate functional hybrid enzymes displaying the SD6 scFv antibody fragment. Characterization of the resultant hybrid proteins indicated that when fusing this fragment to the amino terminus of the enzyme, the protein was stable, it maintained its specific activity and interacted with the target antigen against which the fused antibody fragment was directed. The scFv-enzyme chimera was enzymatically active while bound to the antigen and therefore, it was demonstrated its possible application as single-molecule reagent in ELISA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3505 |
| Date | 28 February 2003 |
| Creators | Alcalá Morales, Pilar Lucía |
| Contributors | Villaverde Corrales, Antonio, Avilés, Francesc X. (Francesc Xavier), Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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