El plegament de la cromatina a l’interior dels cromosomes metafàsics segueix sent un dels
problemes més difícils de resoldre de la biologia estructural. La majoria dels models de plegament
més acceptats, que presenten la fibra de cromatina com a unitat bàsica, van ser proposats en
condicions de molt baixa força iònica. Mitjançant múltiples tècniques microscòpiques, es va
observar que els cromosomes metafàsics contenen un nou element bàsic de plegament: la placa
de cromatina. Com a objectiu general, el treball experimental realitzat en aquesta tesi pretén
ampliar el coneixement sobre l’estructura interna dels cromosomes metafàsics utilitzant condicions
iòniques properes a les observades a la metafase. En primer lloc, s’ha estudiat l’estructura dels
cromosomes dins les cèl·lules mitjançant microscòpia de polarització. Per altra banda, s’ha realitzat
un ampli estudi de la capacitat d’autoassociació de fragments de cromatina de cromosomes
metafàsics de cèl·lules humanes en condicions properes a la metafase.
Mitjançant microscòpia de polarització, s’ha vist que els cromosomes metafàsics en medi aquós
dins els sacs cel·lulars, són estructures òpticament isotròpiques. L’isotropia observada permet
concloure que els cromosomes metafàsics no estan formats per piles paral·leles de nucleosomes.
Aquesta possibilitat no exclou però l’associació de les cares laterals dels nucleosomes, que podrien
donar lloc a piles amb diferents orientacions.
Els resultats obtinguts mitjançant microscòpia electrònica de transmissió de fragments de
cromatina obtinguts per digestió amb nucleasa micrococal de cromosomes metafàsics de cèl·lules
humanes, mostren que únicament adopten una conformació estesa quan la concentració iònica del
medi és molt baixa (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). En condicions iòniques properes a la metafase
(10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), els fragments de cromatina obtinguts tenen
la capacitat intrínseca de formar estructures laminars per autoassociació. A més, no s’observen
fibres de cromatina. Les plaques formades per autoassociació presenten les mateixes
característiques que les emanades directament de cromosomes metafàsics: són estructures
compactes, de superfície llisa i multilaminars. L’alçada de les plaques formades per autoassociació
de fragments de cromatina metafàsica determinada a partir de mostres platinades
unidireccionalment és de 6.8 ± 1.0 nm per làmina. Aquest valor coincideix amb l’alçada de les
plaques emanades de cromosomes parcialment desnaturalitzants, observades al grup. L’aparició
d’estructures laminars de gruix superior en mostres sotmeses a incubacions llargues a 25 i 37ºC,
indica l’elevada tendència de les làmines de cromatina d’apilar-se i formar estructures
multilaminars.
Els cossos circulars compactes de 30 nm observats als voltants de les plaques obtingudes, sumat a
la presència d’altres estructures circulars més petites sobre les plaques, suggereix que els cossos
de 30 nm són estructures intermediàries durant el procés de formació de plaques.
Tenint en compte que l’alçada d’un nucleosoma és de 11 nm i que no hi ha evidències que
suggereixin una col·locació en columnes dels nucleosomes a les plaques, els resultats indiquen que
els nucleosomes es distribueixen de forma parcialment inclinada a l’interior de les plaques.
A partir dels resultats obtinguts, es pot suggerir que els nucleosomes a les plaques estan orientats
irregularment. La interdigitació entre les làmines successives permet la interacció entre les cares
laterals dels nucleosomes i dóna estabilitat a les plaques. La tendència a l’autoassociació de
fragments de cromatina metafàsica per formar estructures multilaminars molt estables, suggereix
que les cromàtides contenen cromatina plegada en una forma laminar al seu interior. / The three-dimensional organization of the chromatin filament in metaphase chromosomes is one of
the most challenging problems of structural biology. The most accepted structural models for
chromatin organization in the metaphase chromosome are those that present the chromatin fibber
as a basic unit. However, they were proposed by the use of low ionic strength buffers. Through the
use of several microscopy techniques, it was observed that metaphase chromosomes were built by
a new structural element: the chromatin plate. The main goal of this thesis was to gain further
insight on internal structure of metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Firstly,
it was analysed the entire chromosome structure within the cell using polarizing microscopy; and
secondly, it was analysed the assembly process of digested chromatin fragments from human
metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions.
Through the use of polarizing microscopy, it was observed that metaphase chromosomes in
aqueous solutions under different ionic conditions are optically isotropic. These results exclude the
possibility that nucleosomes are oriented regularly forming parallel columns inside metaphase
chromosomes. Despite of this, it does not exclude the face-to-face and lateral side-by-side
interactions of different nucleosomes, that can already generate columns with several orientations.
The results obtained in the self-assembly process of chromatin fragments obtained after the
digestion of micrococcal nuclease of human metaphase chromosomes observed with transmission
electron microscopy, showed that they appear to be in an extended conformation just under low
ionic strength condition (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). When fragments are treated under
metaphase ionic conditions (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), it was observed
that chromatin filaments generate laminar structures. In addition, there is no presence of
chromatin fibbers. Self assembled plates show the same structural properties than the ones that
emanate directly from metaphase chromosomes (i.e., flat and smooth surface, well-defined edges,
stacking of several layers). Furthermore, the height of the plates obtained by self-assembly
determined in unidirectional shadowing experiments is 6.8 ± 1.0 nm. This value is equal to the
height of the plates emanated from partially denatured chromosomes, which was observed
previously in our group. The presence of thick plates in the experiments performed at 25 and 37ºC
indicate that the self assembled plates can be formed by stacked layers.
Circular structures of 30 nm were observed surrounding the plates but also closely associated with
them. Their presence suggested that these structures are intermediates of the plate generation
process.
Taking into account that the nucleosome height is 11 nm and that there are no evidences that
suggest the presence of nucleosome columns inside the plates, results indicate that nucleosomes
are slightly inclined in the chromatin plates.
In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that there is an irregular orientation of the
nucleosomes inside the chromatin plates. The interdigitation of adjacent layers allows face-to-face
and lateral side-by-side interactions between nucleosomes of successive layers, which confers
stability and compactness to the laminar structure. The metaphase chromatin tendency to generate
multilayered stable structures after a self-assembly process suggests that chromatids are composed
of chromatin folded in a laminar way
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/107901 |
| Date | 13 January 2012 |
| Creators | Milla Astals, Maria |
| Contributors | Dabán Balañá, Juan Ramón, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 190 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0034 seconds