Orientador : Profª. Drª. Luciana Porto Souza Vandenberghe / Coorientadores : Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol e Profª. Drª.Vanete Thomaz Soccol / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 15/06/2015 / Inclui referências : f. 145-166 / Área de concentração: Agroindústria e biocombustíveis / Resumo:As mananases são enzimas aplicadas nos mais diversos segmentos industriais devido à sua capacidade de decompor as cadeias de mananas, presentes na fração hemicelulósica da parede celular vegetal. São produzidas comercialmente por fermentação submersa (FSm) e também estudadas à partir da fermentação no estado sólido (FES) porém, são desconhecidos relatos que abordam sua produção à partir da fermentação semissólida (FESS). A técnica de FESS é uma alternativa para o escalonamento de processos com o emprego de biorreatores, pois une importantes características da FES e da FSm, como por exemplo, o emprego de subprodutos agroindustriais como substratos sólidos e a simplificada recuperação do produto final. Os principais objetivos deste trabalho foram investigar a produção de mananase por via convencional utilizando diferentes técnicas fermentativas (FES, FESS e FSm) e por via recombinante (expressão heteróloga), bem como avaliar a estabilidade do extrato enzimático após o uso de diferentes aditivos, para composição da formulação líquida de mananase. Para tanto, foi realizada seleção de subprodutos agroindutriais para seu emprego como substratos nos processos de FES e FESS, que visaram a produção de mananases por via convencional com o fungo filamentoso Aspergillus niger NRRL 328. A casca de soja (CS) foi o substrato mais eficiente para emprego em processos de FESS, o qual se mostrou viável para produção da mananase (76,86 U mL-1). O aumento da escala produtiva de mananases por FESS foi explorada em biorreatores do tipo Tanque Agitado (STR) e Coluna de Bolhas (BCR), sendo este último, o modelo que apresentou a melhor resposta (30,02 U mL-1). A produção de mananases por via recombinante foi realizada com sucesso quanto à clonagem, obtenção do plasmídeo recombinante e expressão heteróloga pela levedura Pichia pastoris GS115, com índice superior à mananase nativa proveniente da cepa parental A. niger, em condições fermentativas similares. A análise quantitativa aliada ao perfil protéico obtido por SDS-PAGE, revelaram que a mananase recombinante não foi totalmente secretada pela levedura e que sua expressão pode ser melhorada. A formulação líquida de mananases, avaliada quanto à sua estabilidade pela ação de diferentes aditivos e também quanto à sua toxicidade ao organismo teste Artemia salina (CL50), teve sua composição considerada ideal na presença do extrato mananolítico semi-purificado, acrescido de citrato de sódio (0,15%), glicerol (2,5 M) e EDTA (0,01%), com comprovada estabilidade da mananase (99%), sob condição acelerada de armazenamento (50 °C durante 15 dias). A mesma formulação, na faixa de concentração entre 1 e 1,35%, não apresentou toxicidade (CL50) para A. salina. No estudo de estabilidade normal, o armazenamento à 4 °C do extrato mananolítico semi-purificado na ausência de aditivos, impediu a contaminação microbiana e manteve 90% da atividade enzimática durante 120 dias. O desenvolvimento deste trabalho correspondeu às expectativas uma vez que possibilitou avanços importantes acerca da produção de mananases por via convencional e recombinante, bem como a obtenção de produto com bio-atividade e estabilidade comprovadas. Palavras-chave: Mananase, Fermentação Semissólida, Cascas de Soja,
Biorreatores, Formulação Líquida, Expressão Heteróloga. / Abstract: Mannanases are enzymes applied in the most several industrial segments, due its capacity to breaking down mannan chains, founded in the hemicelulosic portion of plant cell wall. Comercially produced by submerged fermentation (SmF) and also studied from solid-state fermentation (SSF), the report from production using semisolid- state fermentation (SSSF) are unknow. The semi-solid-state fermentation technique is an alternative for process scale-up employing bioreactors since it combines important features of SSF and SmF, e.g. the use of agroindustrial byproducts as solid substrates and the simplified recovery of the final product. The main objectives of this work were to investigate the mannanase production by conventional way using different fermentative techniques (SSF, SmF and SSSF) and by recombinant way (heterologous expression), as well as, evaluate the stability of the enzyme extract by studying different additives, which were added to a liquid mananase-based formulation. For this, the screening of several agroindustrial byproducts was carried out to test them as solid substrate in the SSF and SSSF processes for mannanase production by conventional way with the filamentous fungus Aspergillus niger NRRL 328. Soybean husks (SH) was the most efficient substrate for mannanase production by SSSF processes (76.86 U mL-1). Mannanase production scale up by SSSF was exploited in Stirred Tank (STR) and Bubble Column (BCR) bioreactors. STR promoted a better response (30.02 U mL-1). Recombinant mannanase production was conducted success fully in respect to cloning, recombinant plasmimid achieving and heterologous expression by the yeast Pichia pastoris GS115. Superior rates of mannanase production were achieved in comparison to native mannanase from parental strain A. niger in similar fermentative conditions. Quantitative analyzes, combined to the protein profile obtained by SDSPAGE, revealed that the recombinant mannanase was not totally secreted by the yeast and the expression could be improved. The liquid mannanase formulation, evaluated with respect to its stability by the action of several additives and also its toxicity for the organism test Artemia salina (LC50), was composed by the mannanolytic semi-purified extract addicted of sodium citrate (0.15%), glycerol (2.5 M) and EDTA (0.01%). The formulation showed a mannanase stability of 99%, under accelerated storage conditions (50 °C during 15 days). The same formulation in the concentration range between 1 and 1.35%, did not show toxicity (LC50) for A.salina. In the normal stability study, the storage at 4 °C of the pre-purified mannanolytic extract, without additives, did not show microbial contaminations with 90% of enzymatic activity stability during 120 days. The development of this work allowed important advances concerning mannanases production by conventional and recombinant way, as well as, the definition of a mannanase-based product with proven bio-activity and stability. Key-words: Mannanase, Semi-solid-state Fermentation, Soybean Husks, Bioreactors, Liquid Formulation, Heterologous Expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/44760 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Montibeller, Valesca Weingartner |
| Contributors | Soccol, Carlos Ricardo, 1953-, Soccol, Vanete Thomaz, 1954-, Universidade Federal do Paraná. Setor de Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, Vandenberghe, Luciana Porto de Souza |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 166 f. : il., algumas color., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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