La vacuole est un organite qui joue un rôle important dans de nombreux processus de la cellule végétale, et en particulier dans la protection contre les toxiques cellulaires. Parmi ceux-ci, le cadmium est un polluant courant qui affecte les fonctions physiologiques de la plante. La vacuole est connue pour sa capacité à séquestrer les ions métalliques présents dans le cytosol. Toutefois, les acteurs protéiques de cette compartimentation, et notamment les transporteurs, ne sont pas bien connus. Afin de mieux comprendre le rôle de cet organite dans les mécanismes de protection contre le stress métallique, nous avons mis en place une série d'outils d'analyse du protéome vacuolaire, dans le but de réaliser une caractérisation protéomique de référence de cet organite, utile pour l'étude de sa dynamique en conditions de stress. Mon travail a consisté dans un premier temps à mettre au point une méthode de purification de vacuoles à partir de cellules en culture d'Arabidopsis thaliana. La pureté des échantillons obtenus a été confirmée à l'aide de tests biochimiques (western-blots et mesures d'activités enzymatiques) et nous avons pu initier l'analyse par spectrométrie de masse des constituants protéiques de la membrane et de la fraction soluble de la vacuole. Celle-ci a permis d'identifier 689 protéines non-redondantes, dont 110 transporteurs. La localisation in vivo de 5 d'entre elles a été réalisée via l'expression in planta de ces protéines fusionnées à la GFP. Cette première approche protéomique a été complétée d'une étude plus approfondie du protéome vacuolaire, visant à en acquérir des notions quantitatives et organisationnelles. Pour cela, des gels d'électrophorèses bidimensionnelles (IEF / SDS-PAGE) ont été réalisés à partir de la fraction soluble des vacuoles. Les spots résolus ont été quantifiés via le logiciel d'analyse d'images PDQuest et identifiés par spectrométrie de masse. Cette étude a permis de mettre en évidence un certain nombre de protéines majeures de ce compartiment et a porté le nombre total de protéines vacuolaires identifiées par nos travaux à 709. Quelques protéines connues pour être cytosoliques ont toutefois été retrouvées, et une cartographie du protéome cytosolique a également été réalisée afin de la comparer avec celle du protéome soluble de la vacuole et tenter de mieux comprendre l'origine de ces protéines. Cette analyse a été complétée d'une expérience préliminaire de digestion de vacuoles intactes par la protéinase K. Les résultats obtenus suggèrent la présence de protéines à l'intérieur de la vacuole (probablement en cours de dégradation), et d'autres associées à la face externe du tonoplaste probablement de façon spécifique. Enfin, la présence de complexes protéiques a été évaluée à travers la réalisation d'électrophorèses en conditions non dénaturantes qui ont permis de retrouver des complexes connus (ATPase vacuolaire) mais aussi de mettre en évidence plusieurs complexes putatifs de protéines diverses (protéases, glycosidases ...). Un dernier aspect de mon travail a enfin consisté à développer un outil informatique d'exploitation de données d'analyses à haut débit. La confrontation, grâce à cette structure, des résultats de protéomiques vacuolaires et d'autres d'expression génique lors d'un stress cadmium ont permis d'identifier des protéines présentes dans (ou associées à) la vacuole dont le niveau de transcrit est modulé lors d'un stress. Ces analyses croisées ont notamment mis en évidence la protéine DWARF1, qui catalyse une étape de la biosynthèse des brassinostéroïdes, une classe d'hormones. L'étude de l'implication de cette hormone a alors montré que celle-ci est capable de moduler la tolérance au cadmium de plantules, très probablement via des mécanismes qui n'ont encore jamais été identifiés. L'ensemble de ce travail constitue une base pour l'étude ultérieure de la dynamique du protéome vacuolaire. Il propose des méthodes et des outils d'analyse, ainsi qu'une série de données de référence, pour mieux comprendre les processus vacuolaires de la détoxication métallique, et a d'ores et déjà permis de mettre en évidence des aspects nouveaux du fonctionnement de cet organite.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00652513 |
| Date | 31 October 2008 |
| Creators | Villiers, Florent |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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