Introduction : De nombreuses thérapeutiques ciblant la protéine HER2 ou des protéines clés de la voie HER2 ont transformé le pronostic des cancers du sein HER2 positif. Les anomalies moléculaires tumorales, la richesse des thérapeutiques actuelles et leur coût nécessitent de rationnaliser la décision thérapeutique par l’utilisation de biomarqueurs. La protéomique ciblée, capable de détecter et mesurer un panel de protéines au sein d’échantillons complexes, est l’une des approches les plus performantes pour quantifier un jeu de biomarqueurs spécifiques simultanément dans un tissu tumoral. Objectif : développer une approche de protéomique quantitative ciblée de type PRM (Parallel Reaction Monitoring) pour évaluer les protéines clés de la voie HER2 dans différents échantillons tumoraux. Résultats : 1/ Sélection des peptides protéotypiques de nos protéines d’intérêt (EGFR, HER2 et phospho-HER2, HER3, PTEN) et développement des méthodes d’analyse. 2/ Détection et quantification de ces peptides a/ dans 17 lignées cellulaires mammaires, en conditions standard et après exposition au trastuzumab ou lapatinib. b/ dans des xénogreffes dérivées de cancer du sein humain. 4/ Corrélation des résultats a/ aux « gold » standards actuels : western blot et immuno-cyto/histo-chimie, b/ aux données issues d’analyses transcriptomiques validées. Conclusion : cette approche pourrait permettre dans le futur une vision globale de l’expression et l’activation des protéines de la voie HER2 et progresser vers une médecine « personnalisée ». Elle pourrait être améliorée par l’utilisation de spectromètres de masse plus performants et le recours à la microdissection laser sur tissu conservé en FFPE. / Therapeutics targeting HER2 protein or its pathway considerably improved the prognosis of HER2-positive BC. The actual approaches to evaluate HER2 expression, immunohistochemistry (IHC) and FISH (fluorescent in situ hybridization), are labor-intensive and low-throughput, and present discrepancies between them. Therefore, there is a real need to develop other strategies to rationalize the use of targeted therapeutics. Parallel Reaction Monitoring (PRM) is a mass spectrometry-based approach for targeted proteomics able to detect and quantify numerous proteins with high-throughput allowing to follow mutated or activated status of targeted proteins. PRM could be a way to rationalize the use of targeted therapeutics to go through a more « personalized » medicine. The objective was to detect and quantify proteins implicated in HER2 pathway (EGFR, HER2, HER3, PTEN), phosphorylated peptides of HER2 and their response under treatment. We first selected proteotypic peptides of each protein and protein assays were generated. We detected and quantified proteotypic peptides of proteins of interest 1/on 17 breast cell lines on control condition and under treatment (trastuzumab or lapatinib). 2/ on more complex samples including patients-derived xenografts and human breast cancers. We correlated our data to gold standards western blot and IHC and to transcriptomic signatures previously validated. In the future, this approach could envision a picture of the expression and activation of proteins implicated in HER2-pathway. However, our strategy could be improved by more efficient mass spectrometers and the use of formalin-fixed paraffin-embedded samples to be used in clinical practice.

La vacuole est un organite qui joue un rôle important dans de nombreux processus de la cellule végétale, et en particulier dans la protection contre les toxiques cellulaires. Parmi ceux-ci, le cadmium est un polluant courant qui affecte les fonctions physiologiques de la plante. La vacuole est connue pour sa capacité à séquestrer les ions métalliques présents dans le cytosol. Toutefois, les acteurs protéiques de cette compartimentation, et notamment les transporteurs, ne sont pas bien connus. Afin de mieux comprendre le rôle de cet organite dans les mécanismes de protection contre le stress métallique, nous avons mis en place une série d'outils d'analyse du protéome vacuolaire, dans le but de réaliser une caractérisation protéomique de référence de cet organite, utile pour l'étude de sa dynamique en conditions de stress. Mon travail a consisté dans un premier temps à mettre au point une méthode de purification de vacuoles à partir de cellules en culture d'Arabidopsis thaliana. La pureté des échantillons obtenus a été confirmée à l'aide de tests biochimiques (western-blots et mesures d'activités enzymatiques) et nous avons pu initier l'analyse par spectrométrie de masse des constituants protéiques de la membrane et de la fraction soluble de la vacuole. Celle-ci a permis d'identifier 689 protéines non-redondantes, dont 110 transporteurs. La localisation in vivo de 5 d'entre elles a été réalisée via l'expression in planta de ces protéines fusionnées à la GFP. Cette première approche protéomique a été complétée d'une étude plus approfondie du protéome vacuolaire, visant à en acquérir des notions quantitatives et organisationnelles. Pour cela, des gels d'électrophorèses bidimensionnelles (IEF / SDS-PAGE) ont été réalisés à partir de la fraction soluble des vacuoles. Les spots résolus ont été quantifiés via le logiciel d'analyse d'images PDQuest et identifiés par spectrométrie de masse. Cette étude a permis de mettre en évidence un certain nombre de protéines majeures de ce compartiment et a porté le nombre total de protéines vacuolaires identifiées par nos travaux à 709. Quelques protéines connues pour être cytosoliques ont toutefois été retrouvées, et une cartographie du protéome cytosolique a également été réalisée afin de la comparer avec celle du protéome soluble de la vacuole et tenter de mieux comprendre l'origine de ces protéines. Cette analyse a été complétée d'une expérience préliminaire de digestion de vacuoles intactes par la protéinase K. Les résultats obtenus suggèrent la présence de protéines à l'intérieur de la vacuole (probablement en cours de dégradation), et d'autres associées à la face externe du tonoplaste probablement de façon spécifique. Enfin, la présence de complexes protéiques a été évaluée à travers la réalisation d'électrophorèses en conditions non dénaturantes qui ont permis de retrouver des complexes connus (ATPase vacuolaire) mais aussi de mettre en évidence plusieurs complexes putatifs de protéines diverses (protéases, glycosidases ...). Un dernier aspect de mon travail a enfin consisté à développer un outil informatique d'exploitation de données d'analyses à haut débit. La confrontation, grâce à cette structure, des résultats de protéomiques vacuolaires et d'autres d'expression génique lors d'un stress cadmium ont permis d'identifier des protéines présentes dans (ou associées à) la vacuole dont le niveau de transcrit est modulé lors d'un stress. Ces analyses croisées ont notamment mis en évidence la protéine DWARF1, qui catalyse une étape de la biosynthèse des brassinostéroïdes, une classe d'hormones. L'étude de l'implication de cette hormone a alors montré que celle-ci est capable de moduler la tolérance au cadmium de plantules, très probablement via des mécanismes qui n'ont encore jamais été identifiés. L'ensemble de ce travail constitue une base pour l'étude ultérieure de la dynamique du protéome vacuolaire. Il propose des méthodes et des outils d'analyse, ainsi qu'une série de données de référence, pour mieux comprendre les processus vacuolaires de la détoxication métallique, et a d'ores et déjà permis de mettre en évidence des aspects nouveaux du fonctionnement de cet organite.

Schizosaccharomyces pombe est devenu un important système modèle pour étudier les processus physiologiques, biochimiques et génétiques chez l'homme. Ces travaux appartiennent à un projet sur la façon dont la fonction altérée de l'appareil de Golgi contribue à des maladies comme le cancer ou cause des anormalités génétiques. La protéine HID-1 de C. elegans et des humains est une protéine de l'appareil de Golgi qui appartient à la superfamille de protéines DYMECLIN. Les animaux ont à la fois un gène HID1 et un gène DYM. Chez les humains, une expression réduite de HID1 est impliquée dans la prolifération de tumeurs. La perte de DYM chez les humains mène à une déformation squelettique. S. pombe a trois gènes orthologues HID-1, mais pas de DYM. Par contraste, de nombreux eucaryotes unicellulaires et pluricellulaires n'ont qu'un gène DYM. Les mutants de S. pombe sans Hid1 et Hid3 étaient sensibles au stress oxydatif et la croissance de hid3Δ a été stoppée dans des milieux de culture minimum standard. L'insensibilité de hid3Δ au brefeldin A, mais sa sensibilité au golgicide A démontrent que Hid3 fonctionne dans le transport antérograde à travers l'appareil de Golgi. Afin d'explorer des rapports indiquant que le renouvellement des protéines pourrait être modifié dans hid3Δ, j'ai entrepris une étude de protéomique à la quantification label-free. La régulation positive de la voie de signalisation MAPK de tension a démontré que les cellules étaient dans un état de tension dans des conditions normales de croissance. De plus, des composants de protéine dans plusieurs voies de signalisation étaient modifiés, pouvant affecter une large gamme de processus cellulaires. / Schizosaccharomyces pombe has become an important model system to study physiological, biochemical and genetic processes in humans. This work is part of a continuing project to study how altered Golgi function contributes to diseases, such as cancer, or causes of genetic abnormalities. The HID-1 protein of C. elegans and humans are peripheral membrane proteins of the Golgi apparatus and are part of the DYMECLIN superfamily of proteins. Animals have both a HID1 and a DYM gene. In C. elegans, HID-1 maintains normal cellular growth and in humans reduced expression of HID1 has been implicated in tumour proliferation. Loss of DYM in humans leads to skeletal deformation and potentially mental retardation. S. pombe has three HID-1 orthologues, but no DYM. In contrast, many unicellular and multicellular eukaryotes have only DYM. S. pombe mutants lacking Hid1 and Hid3 were sensitive to oxidative stress and growth of hid3Δ was stopped in standard minimal media. Insensitivity of hid3Δ to brefeldin A but sensitivity to golgicide A demonstrated that Hid3 operates in anterograde protein transport through the Golgi. In order to investigate reports that protein turnover might be altered in hid3Δ, I undertook a proteomics study using label-free protein quantification. Up-regulation of the MAPK stress signalling pathway demonstrated that cells were under a state of stress under standard growth conditions. In addition, protein components of Ras signalling, microtubule dynamics and chromatin remodelling were altered potentially affecting a wide variety of processes from cell cycle regulation to metabolism.

La pourriture grise causée par Botrytis cinerea est l'une des principales maladies de la vigne. La principale solution pour faire face à cette maladie est l'utilisation de produits chimiques, mais la lutte chimique cause des dommages environnementaux et conduit au développement de souches de B. cinerea résistantes. Une stratégie alternative consiste à stimuler les mécanismes de défense naturelle de la vigne. Cependant, B. cinerea est connu pour contourner les défenses de la plante (El Oirdi et Bouarab, 2011) et à ce jour aucun éliciteur n'a montré d'effet protecteur probant contre B. cinerea. De plus, les résultats prometteurs observés au laboratoire se révèlent souvent décevants au vignoble et à ce jour aucun produit stimulateur de défense ne confère à la vigne une protection acceptable contre la pourriture grise. Pour développer des éliciteurs efficaces contre la pourriture grise, il s'avère donc essentiel de caractériser des marqueurs de protection qui permettraient de distinguer stimulation des défenses et protection efficace de la vigne contre B. cinerea. Pour ce faire des analyses comparatives ont été réalisées par 2D-PAGE afin de comparer au niveau protéique l'effet d'éliciteurs induisant une protection et l'effet d'éliciteur n'induisant pas une protection. Les recherches se sont concentrées sur l'apoplaste, qui est un réseau continu dans les plantes créant une interface avec l'environnement. Après la cuticule, l'apoplaste est ainsi la première barrière contre les attaques d'agents pathogènes (Agrawal et al., 2010). Afin d'obtenir un aperçu du protéome constitutif de l'apoplaste (secrétome), une méthode d'infiltration-centrifugation a été optimisée afin de recueillir le fluide apoplastique à partir de feuilles de vigne. Les profils protéiques apoplastiques ont ensuite été comparés aux profils protéiques de feuilles entières par 2D-PAGE et les protéines identifiées par spectrométrie de masse. Cette approche nous a permis d'établir une carte protéique des feuilles entières et du secrétome de la vigne. A notre connaissance, cette étude fournit la première carte protéique du secrétome de la vigne. Cette étude nous donne ainsi un aperçu des protéines les plus abondantes de l'apoplaste de feuilles de vigne. Une prédiction de la fonction des protéines nous a permis de conclure que l'apoplaste de vigne contient principalement (i) des protéines liées aux stress, (ii) des protéines impliquées dans le métabolisme de la paroi cellulaire et (iii) des protéases. Pour confirmer la qualité des extractions, l'analyse prédictionnelle de la sécrétion des protéines a révélé une forte proportion de protéines secrétées de manière classique et non classique (Leaderless Secreted Proteins, LSP). Cette approche offre un grand nombre de protéines candidates impliquées dans les diverses fonctions physiologiques de l'apoplaste. (…)Parallèlement cette étude présente les travaux préliminaires entrepris, également par 2D-PAGE, pour (i) mettre en évidence des marqueurs de potentialisation chez la vigne, (ii) mettre en évidence les bouleversements, au niveau protéique, causés par une infection de B. cinerea sur la vigne et (iii) comprendre comment un traitement avec un éliciteur protecteur pourrait limiter ces effets néfastes. La validation de ces marqueurs par différentes approches permettra d'améliorer la compréhension des mécanismes de défense des plantes et le développement d'outils pour le criblage de nouveaux éliciteurs candidats pour leurs effets protecteurs contre la pourriture grise et pour le suivi des défenses de la vigne directement au vignoble. / Grey mould caused by Botrytis cinerea infection is one of the main diseases affecting grapevine. The main solution to cope with this disease is the use of chemicals, but chemical control cause environmental damages and lead to the development of B. cinerea resistant strains. An alternative strategy to prevent diseases consists in stimulating plant defense mechanisms. Nevertheless B. cinerea is known to manipulate plant defenses (El Oirdi and Bouarab, 2011) and to date no elicitors have shown expected protective effect against B. cinerea even if they stimulate defense markers. Moreover despite that numerous studies showed an excellent efficacy of elicitors in laboratory conditions, in vineyard the obtained results are often disappointing.Thus it is necessary to distinguished elicitors inducing protection (protective elicitor) from elicitors inducing defense but no protection (non protective elicitors). For that it appears crucial to characterize markers which would enable to discriminate grapevine defense stimulation from effective protection against B. cinerea. To reach this goal, comparative analyses were performed by 2D-PAGE in order to compare the effect of protective elicitors from non protective elicitors against B. cinerea on grapevine apoplastic fluids. Those biomarkers could be defined as protection biomarkers.Researches were focused on the apoplast, which is a continuous network in plants and creates an interface with the environment. After the cuticle, apoplast is the first barrier against pathogen attacks (Agrawal et al., 2010). In order to obtain an overview of the constitutive apoplastic proteome (secretome), a vacuum-infiltration-centrifugation method was optimized to collect the apoplastic fluid from grapevine leaves. Apoplastic protein profiles were compared to whole-leaf protein profiles by 2D-PAGE and protein identifications were performed by tandem mass spectrometry. This approach allowed us to establish a well-defined proteomic map of whole-leaf and apoplastic leaf. To our knowledge, it is the first time that the apoplastic fluid is recovered from grapevine to characterize its protein content. This study provides a comprehensive overview of the most abundant proteins present in grapevine apoplast. Protein function prediction allowed us to conclude that the grapevine apoplast mainly contains a high proportion of (i) stress-related proteins, (ii) proteins involved in cell wall metabolism, (iii) proteases. To confirm quality of extractions, proteins secretion prediction tools revealed a high proportion of classical and non-classical secreted proteins namely Leaderless Secreted Proteins (LSP). This approach provides thus a large number of candidate proteins involved in physiological functions of the apoplast under various stresses.Differential analyses let us to highlight 7 putative markers, namely an aspartyl protease, a β-1,3 glucanase, an isoflavone reductase for induced markers and an another aspartyl protease, an another β-1,3 glucanase, a germin-like protein and a serine pyruvate amino transferase for repressed markers. This proteins could act in a concert manner to (i) regulate reactive oxygen species homeostasy and dercease programmed cell death, (ii) counteract B. cinerea virulence factors, (iii) increase plant cell wall stiffening, (iv) cause fungal membrane leakage and (v) participate in the induction of systemic defence responses.In addition, this study provides preliminary research performed to highlight (i) priming biomarkers in grapevine, (ii) damages caused by B. cinerea infection on grapevine proteome and (iii) how a protective elicitor treatment could limit those damages.Further functional analyses of these proteins will improve the understanding of plant defense mechanisms and tools development for large scale screening of new elicitors regarding their protective effects against grey mould disease and for following grapevine defenses in vineyard.

L'analyse protéomique du tissu cérébral pathologique dans la maladie de Parkinson (MP) est un enjeu majeur à l'identification des causes moléculaires de la dégénérescence en vue de développer des thérapies curatives. Jusqu'à présent, les études chez l'humain se sont limitées à l'analyse du cerveau post-mortem, trop souvent représentatif d'un stade très avancé de la maladie et potentiellement altéré par différents facteurs. Dans ce travail, nous avons exploité l'accès temporaire au cerveau parkinsonien durant l'implantation d'électrodes de stimulation, pour obtenir une information moléculaire du tissu cérébral, in vivo et à un stade moins avancé de la maladie. Afin d'optimiser notre stratégie, nous avons ensuite développé un outil dédié à la capture tissulaire dont l'efficacité et le caractère non lésionnel ont été validés in vivo chez le primate. Ce travail permet d'envisager l'analyse protéomique du cerveau parkinsonien « vivant » afin d'identifier les causes moléculaires de la MP. En revanche, cette approche tissulaire n'est pas envisageable pour un diagnostic en routine clinique. Aussi, de nombreux groupes s'intéressent à l'analyse protéomique du LCR en vue d'identifier des marqueurs diagnostiques. Dans cette optique, nous avons mis au point une stratégie, basée sur l'utilisation de nanoparticules (NPs) fonctionnalisées qui a permis un enrichissement considérable des profils protéiques observés en spectrométrie de masse. La reproductibilité et la possibilité d'automatiser intégralement la préparation des échantillons font de notre approche une solution adaptée à la recherche de marqueurs moléculaires diagnostiques de la MP dans le LCR. Nous avons aussi démontré l'intérêt de notre approche pour l'analyse protéomique du plasma et du globule rouge. Enfin, nous avons évalué la possibilité d'utiliser ces NPs in vivo, pour une capture des protéines directement dans la circulation sanguine. / Proteomics analysis of pathological brain tissue in Parkinson's disease (PD) is of great importance to understand the molecular aetiology of degeneration and to develop curative treatments. To date, published studies have been restricted to the analysis of human post-mortem tissue samples, frequently derived from advanced disease stage and potentially altered by several factors. In this project we took advantage of the temporary access to PD patient's brain during electrode implantation to obtain in vivo molecular information from cerebral tissue at earlier stage of the disease. We further developed a dedicated tool to improve our tissue harvesting approach, and validated its efficiency and non-lesion effects in vivo in monkeys. This work opens the way to the proteomic analysis of fresh human brain samples to elucidate molecular causes of degeneration in PD. However such tissue investigation approach remains invasive and cannot be used in routine clinical screening for PD diagnosis. Proteomics analysis of cerebrospinal fluid (CSF) constitutes a promising alternative to identify neuropathological diagnosis markers. For this purpose, we developed a nanoparticle-assisted strategy enabling the enrichment of CSF proteins detection by mass spectrometry. Reproducibility and high throughput potentiality of our approach demonstrate its compatibility with clinical proteomics for PD diagnosis biomarker research in CSF. We also demonstrated the interest of this NP strategy for plasma and red blood cells proteome analysis. Finally, we evaluated the ability to use these NPs for in vivo protein harvesting in blood.

Background and aims : Crohns disease (CD) and ulcerative colitis (UC) known as inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic immuno-inflammatory pathologies of the gastrointestinal tract. These diseases are multifactorial, polygenic and of unknown etiology. Clinical presentation is non specific and diagnosis is based on clinical, endoscopic, radiological and histological criteria. Novel biomarkers are needed to improve early diagnosis and classification of these pathologies as well as to monitor or predict the effects of therapy. Methods We performed a study with 120 serum samples collected from patients classified in 4 groups: 30 CD, 30 UC, 30 inflammatory controls (IC) and 30 healthy controls (HC), according to accredited criteria. We compared protein sera profiles obtained with a Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometer (SELDI-TOF-MS). Data analysis with an original multivariate statistical method based on multiple decision trees algorithms allowed us to select new potential biomarkers. Eight of them were purified and identified by mass spectrometry and antibody based methods. Moreover, a similar analysis was applied on sera taken from patients before and after treatment with Infliximab. We obtained multivariates models based on biomarkers able to predict the response and monitor changes in protein profiles before and after therapy. One biomarker was identified by an antibody based method and is able to predict clinical response to anti-TNF therapy. Results : Multivariate analysis generated models that could classify samples with good sensitivity and specificity (minimum 80%) discriminating IBD versus HC and IC or CD versus UC. The discrimination of these multivariate models and those of some identified combined biomarkers were compared to ASCA and ANCA tests and showed better or equivalent power of discrimination. Eight biomarkers were purified and identified: Platelet aggregation Factor 4 (PF4), the Myeloid Related Protein 8 (MRP8), the Fibrinopeptide A (FIBA), the Haptoglobin α2 subunit (Hpα2). They were detected in sera by classical methods, when available. Unique decision tree was built with these biomarkers and correlations with characteristics of patients and between biomarkers were calculated. Finally, we also adressed with a similar strategy predictor of response to Infliximab therapy. Conclusions : SELDI-TOF-MS technology combined with the use of the multiple decision trees method, as robust statistical tool, led to the selection of protein biomarker patterns and of specific biomarkers which could be helpful for diagnosis of inflammatory bowel diseases and prediction of therapy effects as well as understanding of these diseases pathophysiology. Buts : La maladie de Crohn (CD) et la rectocolite ulcéro-hémorrhagique (UC), désignées conjointement sous le nom « Inflammatory Bowel Disease » (IBD), sont deux maladies inflammatoires chroniques de lintestin. Ces pathologies nont pas une étiologie formellement identifiée et semblent être multifactorielles et polygéniques. Leurs présentations cliniques sont aspécifiques et leur diagnostic est actuellement basé sur les données cliniques, endoscopiques, radiologiques et histologiques. Ainsi, de nouveaux marqueurs spécifiques et sensibles de ces pathologies sont nécessaires afin daméliorer le diagnostic précoce et la classification de ces pathologies, ainsi que pour suivre, voire prédire la réponse aux traitements. Méthodes : Une étude protéomique a été réalisée sur 120 échantillons sériques provenant de patients classés en 4 groupes (30 CD, 30 UC, 30 IC et 30 HC), suivant les critères accrédités. Nous avons comparé les profils protéiques obtenus par « Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometer » (SELDI-TOF-MS). Lanalyse des données avec une méthode statistique multivariée originale, basée sur la construction darbres de décisions multiples, nous a permis de sélectionner certains biomarqueurs potentiels. Huit dentre eux ont été identifiés par spectrométrie de masse et des techniques de reconnaissance spécifique par anticorps. De plus, une analyse similaire a été effectuée sur des échantillons provenant de patients avant et après traitement par Infliximab. Nous avons obtenu à partir des profils protéiques, des modèles de classification statistiques multivariés et finalement certains biomarqueurs potentiels de prédiction de la réponse au traitement. De plus, un biomarqueur a été identifié par reconnaissance via un anticorps spécifique. Résultats : Lanalyse multivariée a généré des modèles de classification présentant de bonnes sensibilités et spécificités (minimum 80%) pour la discrimination des patients IBD versus contrôles ou encore, CD versus UC. Les résultats ont été comparés avec ceux des tests ASCA et ANCA et montrent une efficacité équivalente ou supérieure. Huit biomarqueurs ont été purifiés et identifiés : le facteur dagrégation plaquettaire 4 (PF4), la protéine MRP8 ou «Myeloid Related Protein 8», le fibrinopeptide A (FIBA), la sous-unité α2 de lhaptoglobine (Hpα2). Ces protéines et peptides ont été détectés, lorsque possible, dans le sérum par les méthodes classiques. Un arbre de décision multiple a été construit sur base de ces biomarqueurs. Les corrélations entre ceux-ci et avec les caractéristiques des patients ont été également évaluées. Conclusions : La technique SELDI-TOF-MS combinée à lutilisation des arbres de décisions multiples en temps que méthode danalyse statistique robuste, a mené à lobtention de signatures protéiques caractéristiques et à la sélection de biomarqueurs spécifiques qui peuvent se révéler utiles au diagnostic des pathologies IBD, au suivi, comme à la prédiction des effets des thérapies et à la compréhension de la physiopathologie de ces maladies

RESUME : Le Quorum Sensing est un système de communication bactérien permettant à une population de coordonner l’expression de gènes cibles en fonction de sa densité ou des propriétés du milieu (diffusion, flux....). Chez les bactéries à Gram négatif, le Quorum Sensing est basé sur la synthèse et la détection de petites molécules signal appelées N-acyl-homosérine lactones (AHLs). Les régulateurs transcriptionnels de type LuxR sont les médiateurs de ce système de régulation. Lorsque la concentration en AHLs augmente, ces molécules se fixent au domaine N-terminal d’un régulateur LuxR et provoquent des changement conformationnels entraînant une modification de l’activité du régulateur. Un tel système de régulation a été mis en évidence chez la bactérie Gram négative Brucella melitensis. Cette bactérie pathogène intracellulaire synthétise une dodécanoyl-homosérine lactone (C12-HSL) et possède deux régulateurs de type LuxR : VjbR et BabR. VjbR est impliqué dans la virulence de B. melitensis et est indispensable à l’expression de deux facteurs de virulence: le système flagellaire et le système de sécrétion de type IV VirB. Les C12-HSL ont quant à elles un effet répresseur sur ces deux structures membranaires. Durant ce travail, la mutation du domaine Nterminal du régulateur VjbR a permis de démontrer la capacité de VjbR à médier l’effet des C12-HSL sur l’opéron virB. Les souches mutées dans le gène vjbR forment des agrégats en cultures liquides. Nous avons montré que ce phénotype est lié à la production d’un exopolysaccharide, suggérant pour la première fois que Brucella pourrait former des structures de type biofilm. Cette étude a également permis de mettre en évidence un rôle majeur de VjbR dans la régulation de structures de surface puisque ce régulateur est impliqué dans le contrôle de l’expression de nombreuses protéines de membrane externe (Omp). L’utilisation de la technique d’immunoprécipitation chromatinienne (ChIP) a permis de montrer que VjbR régule directement deux de ces Omps ainsi que l’opéron virB. La virulence de Brucella est en partie basée sur sa capacité à dévier le trafic intracellulaire de ses cellules hôtes (phagocytes professionnels et nonprofessionnels) et à s’y multiplier. Lors de son cycle infectieux, Brucella est confrontée à de nombreux stress et environnements différents, suggérant la nécessité d’une régulation génétique fine en réponse à des stimuli environnementaux. Le Quorum Sensing, de par son implication dans la virulence de ce pathogène pourrait être impliqué dans de telles régulations. Afin d’aborder de façon globale le rôle de VjbR et de BabR chez B. melitensis, des études transcriptomique et protéomique des mutants ΔvjbR et ΔbabR ont été réalisées. Ces études ont permis de mettre en évidence que le Quorum Sensing chez B. melitensis est un système de régulation global, puisqu’il permet de réguler 10% du génome dans les conditions testées (dont 9% sous le contrôle de VjbR). De nombreuses cibles de ces régulateurs sont impliquées dans la virulence et l’adaptation aux conditions de stress (oxydatif, métabolique...), suggérant un rôle important du Quorum Sensing dans l’accomplissement du cycle infectieux de B. melitensis. SUMMARY : Quorum Sensing is a bacterial communication system wich allows the coordinated gene expression within a population regarding its density and environmental properties (diffusion, flow...). In Gram negative bacteria, Quorum Sensing is based on the synthesis and the detection of small diffusible molecules called N-acyl-homoserine lactones (AHLs). LuxR transcriptional regulators are the mediators of these regulation systems. When AHL concentration increases, these molecules bind to the N-terminal domain of a LuxR-type regulator and leads to conformational changes driving the modification of the regulator activity. A similar regulation system has been discovered in the Gram negative bacteria Brucella melitensis. This intracellular pathogen synthesizes a dodecanoylhomoserine lactone (C12-HSL) and possesses two LuxR-type regulators: VjbR and BabR. VjbR is involved in the virulence of this pathogen and is crucial for the expression of two virulence factors : the flagellar system and the type four secretion system VirB. C12-HSL have a repressor effect on these two membrane structures. During this work, mutation of the N-terminal domain of VjbR allowed us to demonstrate the ability of VjbR to mediate C12-HSL effect on the virB operon. vjbR mutated strains aggregate in liquid cultures. We have demonstrated that this phenotype is linked to the production of an exopolysaccharide, suggesting for the first time that Brucella could form biofilm-type structures. This study also demonstrates that VjbR has a major role in the regulation of surface structures because this regulator controls the expression of many outer membrane proteins (Omp). Using the chromatin immunoprecipitation technique (ChIP), we have shown that two of these Omps, as well as the virB operon, are directly regulated by VjbR. The virulence of Brucella is partly based on its ability to deviate the intracellular traffic of its host cells (professional and nonprofessional phagocytes) and to proliferate within these cells. During its infectious cycle, Brucella faces numerous stresses and environments, suggesting the necessity of a finely tuned genetic regulation depending on environmental stimuli. Quorum Sensing, through its involvement in the virulence of this intracellular pathogen, could be involved in such regulations. In order to investigate the role of VjbR and BabR in B. melitensis, global transcriptomic and proteomic studies of ΔvjbR and ΔbabR mutants were performed. These studies demonstrate that Quorum Sensing is a global regulation system in B. melitensis because it controls the expression of 10% of the genome in the condition tested (9% through VjbR). Numerous targets of these two regulators are involved in virulence and adaptation to environmental stresses (oxydative, metabolic...), suggesting an important role of Quorum sensing in the achievement of the infectious cycle of B. melitensis.

Les nanoparticules (NP) métalliques occupent une place de plus en plus importante, tant dans les procédésindustriels que dans la recherche biomédicale. Néanmoins, les données sur leur toxicité potentielle pour lesorganismes vivants restent insuffisantes, notamment à l’échelle moléculaire. Des exemples historiques montrentque certaines pathologies, comme la silicose et l’asbestose, peuvent être engendrées par l’exposition chroniqueà des particules inorganiques (silice et fibres d’amiante). Dans les deux cas, la réponse des macrophagesalvéolaires est en grande partie responsable de la maladie. Les macrophages sont en effet la première ligne dedéfense (immunité innée) contre toute attaque exogène, pathogène ou non, du fait de leurs fortes capacitésphagocytaires et de leurs propriétés inflammatoires. Ainsi, les objectifs de ces travaux étaient d’étudier les effetsde deux types de NP métalliques (Cu/CuO et ZnO) sur deux lignées cellulaires de macrophages murins. Cetteétude a été réalisée par une approche protéomique basée sur l’électrophorèse 2D et la spectrométrie de masse,permettant d’accéder de façon reproductible à des données mécanistiques. Les données obtenues ont étévalidées par plusieurs approches ciblées de biologie cellulaire, sur les lignées ainsi que sur des macrophagesprimaires. Nos résultats montrent que les deux types de NP engendrent des réponses différentes, bien que leurdegré élevé de cytotoxicité soit similaire. Les NP de cuivre induisent un stress oxydant et une réponsemitochondriale intenses, associées à de fortes perturbations de la phagocytose et de la production de certainsmédiateurs de l’inflammation. Cette toxicité semble être essentiellement liée aux propriétés redox du cuivre, etest spécifique de la forme nanoparticulaire. A l’inverse, le zinc induit des réponses modérées sur les mêmesprocessus, n’affectant pas a priori le rôle immunitaire des macrophages. Cette toxicité n’est pas non plusspécifique des NP, les ions ayant des effets très étendus, liés à leurs interactions avec de nombreuses protéines,perturbant leur fonctionnement normal jusqu’à induire la mort cellulaire. L’ensemble de ces résultatspermettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la toxicité de ces NP. / Metallic nanoparticles (NPs) are more and more widely used, from industrial processes to biomedical research.However, data on their potential toxicity towards organisms are still lacking, especially regarding molecularmechanisms. It has been proven that some inorganic particles can lead to diseases when tissues are chronicallyexposed. In the case of pulmonary silicosis and asbestosis, induced by silica particles and asbestos fibers, chronicinflammation through alveolar macrophages is responsible for the disease. Indeed, macrophages are the firstdefense against exogenous attacks, like pathogens or inorganic compounds, which are eliminated throughphagocytosis and inflammatory processes that are part of the innate immune response. Thus, this study aimedat analyzing the molecular effects of both copper- and zinc-based NPs (Cu/CuO and ZnO) on murinemacrophages cell lines. To this end, a reproducible proteomic-based approach using 2D electrophoresis andmass spectrometry was used. The proteomic data were validated using targeted approaches on both cell linesand primary macrophages. Our results show that both NPs exert similar high cytotoxicity, but the molecularresponses are markedly different. Copper-based NPs strongly induce oxidative stress as well as alterations inmitochondrial metabolism, phagocytosis, and inflammatory mediators’ production. These effects seem to bemostly related to the redox properties of copper, and are specific to the NP form. Conversely, zinc inducedlimited effects on the same processes, thus leading to no significant alterations in macrophages’ immunefunctions. These effects are not NP-specific, since Zn2+ ions seem to exert most of them, probably due to theirability to interact with numbers of proteins, slightly altering their normal functions, and eventually leading onlyto cell death without prior functional alterations. This study allowed us to highlight some molecular mechanismsof both NP’s toxicity.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques nécessaires à la protection des extrémités des chromosomes contre les dégradations ou fusions induites par les processus de réparation de lADN. Ils sont constitués de complexes protéiques associés à des répétitions en tandem dun motif 5-(TTAGGG)-3 sous forme double brin de plusieurs kilobases, et finalisés par une extrémité 3simple brin de la même séquence de quelques centaines de bases. On observe in vitro un raccourcissement des télomères à chaque division cellulaire, ce même fait est corrélé in vivo avec le vieillissement. Lorsque les télomères se raccourcissent et atteignent une taille critique, les cellules entrent en sénescence réplicative qui se définit par un arrêt de croissance définitif et viable des cellules. La télomérase est une ADN polymerase ARN-dépendante qui allonge le télomère en lui ajoutant des séquences répétitives TTAGGG. Elle comprend une composante ARN (hTR) qui sert de matrice et une composante catalytique à activité transcriptase inverse (hTERT). Lexpression seule dhTERT suffit à immortaliser différents types cellulaires. La télomérase est fortement exprimée dans la majorité des cellules tumorales alors que son activité est difficilement détectable dans la plupart des cellules somatiques. Ces observations font de la télomérase une cible dintérêt pour des nouvelles thérapies anticancéreuses. Une de ces nouvelles stratégies consiste en lutilisation de molécules capables de stabiliser les structures en G-quadruplexe de lADN. La stabilisation des G-quadruplexes télomériques rend les télomères inaccessibles pour la télomérase et inhibe son activité par la séquestration de son substrat. Lobjectif de cette thèse est dévaluer la réponse cellulaire induite par le traitement cellulaire de deux ligands des G-quadruplexes au niveau du protéome des cellules WI38 transfectées pour exprimer hTERT. Les deux ligands, TMPyP4 et la télomestatine, inhibent la télomérase mais ont une spécificité différente pour les diverses structures G-quadruplexes. En premier lieu, nous avons étudié leffet de la transfection dhTERT sur des cellules fibroblastiques humaines (WI38). Cette première étude a été conduite afin de caractériser ladaptation cellulaire résultante de limmortalisation des cellules WI38. Par la suite, celle-ci permettra de comparer ces résultats avec ceux obtenus lors de létude protéomique de leffet des ligands des G-quadruplexes. Nous avons montré que hTERT induit une augmentation de la capacité fonctionnelle du réticulum endoplasmique ainsi quune modulation des signaux cellulaire Ca2+-dépendant. Nous proposons que cette adaptation cellulaire est responsable dune résistance accrue vis-à-vis de différents stress environnementaux. Dautres protéines impliquées dans des mécanismes doncogenèse ont été identifiées et sont différentiellement exprimées entre les cellules parentales et les cellules transfectées. Lanalyse protéomique des traitements cellulaires indique que TMPyP4 induit une altération du protéome beaucoup plus prononcée que celle induite par la télomestatine. Ceci est probablement dû au manque de spécificité de TMPyP4 pour les G-quadruplexes télomériques. TMPyP4 induit, entre autres, une sous-expression massive des hnRNPs, une modulation de la voie protéasomale, une diminution probable de la traduction et une surexpression de plusieurs chaperonnes moléculaires. La télomestatine induit notamment une surexpression de la protéine BCL2A1 qui est impliquée dans les processus de résistance aux agents anticancéreux et une probable augmentation de la traduction. Les deux ligands ont des effets communs sur la variation dexpression des chaperons CCT (sou-expression), de lHSP90 alpha (surexpression) et de lhnRNP D (sous-expression). LHSP90 est également surexprimée dans les cellules hTERT-WI38 par rapport aux cellules parentales. Cette protéine fait actuellement lobjet de nombreuses recherches visant à inhiber son activité du fait de son implication en oncogenèse ainsi que dans la modulation de lactivité de la télomérase. Enfin, nous avons montré lintérêt de ce type détude protéomique dans lévaluation dagents à vocation thérapeutique préalablement aux études cliniques.

Une des hypothèses concernant la fonction du sommeil suggère que ce dernier permettrait la plasticité neuronale et l'organisation (ou la réorganisation) synaptique, phénomènes sous-tendant des fonctions cognitives. Des perturbations spécifiques du sommeil faisant suite à un apprentissage ont en effet montré une diminution significative des performances aux niveaux des gènes et du comportement. Notre travail à visé à étudier les conséquences d'une privation de sommeil faisant suite à un apprentissage d'une tâche mnésique au niveau de l'abondance de protéines dans l'hippocampe de rat. Pour ce faire, une première étude protéomique de l'hippocampe de rat en l'absence d'apprentissage spatial spécifique a d'abord été réalisée ; elle montre l'absence de différence quantitative d'abondance protéique entre les hippocampes gauche et droit. Ensuite, une seconde étude protéomique montre qu'une privation de courte durée affecte différents réseaux de protéines, principalement liés au métabolisme cellulaire, aux voies biochimiques de l'énergie, des transports, du trafic vésiculaire, du cytosquelette et du traitement des protéines dans l'hippocampe de rat. Finalement, une troisième étude protéomique montre les effets d'un apprentissage d'une tâche spatiale en début de période d'activité diurne sur le protéome d'hippocampe de rat. Les principales protéines affectées ont ici des fonctions liées au métabolisme cellulaire et au cytosquelette.