Les nanoparticules (NP) métalliques occupent une place de plus en plus importante, tant dans les procédésindustriels que dans la recherche biomédicale. Néanmoins, les données sur leur toxicité potentielle pour lesorganismes vivants restent insuffisantes, notamment à l’échelle moléculaire. Des exemples historiques montrentque certaines pathologies, comme la silicose et l’asbestose, peuvent être engendrées par l’exposition chroniqueà des particules inorganiques (silice et fibres d’amiante). Dans les deux cas, la réponse des macrophagesalvéolaires est en grande partie responsable de la maladie. Les macrophages sont en effet la première ligne dedéfense (immunité innée) contre toute attaque exogène, pathogène ou non, du fait de leurs fortes capacitésphagocytaires et de leurs propriétés inflammatoires. Ainsi, les objectifs de ces travaux étaient d’étudier les effetsde deux types de NP métalliques (Cu/CuO et ZnO) sur deux lignées cellulaires de macrophages murins. Cetteétude a été réalisée par une approche protéomique basée sur l’électrophorèse 2D et la spectrométrie de masse,permettant d’accéder de façon reproductible à des données mécanistiques. Les données obtenues ont étévalidées par plusieurs approches ciblées de biologie cellulaire, sur les lignées ainsi que sur des macrophagesprimaires. Nos résultats montrent que les deux types de NP engendrent des réponses différentes, bien que leurdegré élevé de cytotoxicité soit similaire. Les NP de cuivre induisent un stress oxydant et une réponsemitochondriale intenses, associées à de fortes perturbations de la phagocytose et de la production de certainsmédiateurs de l’inflammation. Cette toxicité semble être essentiellement liée aux propriétés redox du cuivre, etest spécifique de la forme nanoparticulaire. A l’inverse, le zinc induit des réponses modérées sur les mêmesprocessus, n’affectant pas a priori le rôle immunitaire des macrophages. Cette toxicité n’est pas non plusspécifique des NP, les ions ayant des effets très étendus, liés à leurs interactions avec de nombreuses protéines,perturbant leur fonctionnement normal jusqu’à induire la mort cellulaire. L’ensemble de ces résultatspermettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires expliquant la toxicité de ces NP. / Metallic nanoparticles (NPs) are more and more widely used, from industrial processes to biomedical research.However, data on their potential toxicity towards organisms are still lacking, especially regarding molecularmechanisms. It has been proven that some inorganic particles can lead to diseases when tissues are chronicallyexposed. In the case of pulmonary silicosis and asbestosis, induced by silica particles and asbestos fibers, chronicinflammation through alveolar macrophages is responsible for the disease. Indeed, macrophages are the firstdefense against exogenous attacks, like pathogens or inorganic compounds, which are eliminated throughphagocytosis and inflammatory processes that are part of the innate immune response. Thus, this study aimedat analyzing the molecular effects of both copper- and zinc-based NPs (Cu/CuO and ZnO) on murinemacrophages cell lines. To this end, a reproducible proteomic-based approach using 2D electrophoresis andmass spectrometry was used. The proteomic data were validated using targeted approaches on both cell linesand primary macrophages. Our results show that both NPs exert similar high cytotoxicity, but the molecularresponses are markedly different. Copper-based NPs strongly induce oxidative stress as well as alterations inmitochondrial metabolism, phagocytosis, and inflammatory mediators’ production. These effects seem to bemostly related to the redox properties of copper, and are specific to the NP form. Conversely, zinc inducedlimited effects on the same processes, thus leading to no significant alterations in macrophages’ immunefunctions. These effects are not NP-specific, since Zn2+ ions seem to exert most of them, probably due to theirability to interact with numbers of proteins, slightly altering their normal functions, and eventually leading onlyto cell death without prior functional alterations. This study allowed us to highlight some molecular mechanismsof both NP’s toxicity.

La cryptogéine, une protéine sécrétée par l'oomycète Phytophthora cryptogea, provoque la mise en place de mécanismes de défense chez le tabac, mobilisant au cours des étapes précoces de la signalisation associée, des protéines localisées dans la membrane plasmique (MP). Une fraction membranaire résistante à la solubilisation par les détergents (DIM pour Detergent Insoluble Membrane), enrichie en stérols et en sphingolipides avait été purifiée à partir de la MP de tabac : cette fraction contenait plusieurs protéines impliquées dans la cascade de signalisation induite par la cryptogéine. Chez l'animal, l'association dynamique de protéines à des microdomaines riches en stérols et sphingolipides en réponse à un stress biotique joue un rôle essentiel dans la régulation de la signalisation cellulaire. L'objectif de ce travail était de tester l'hypothèse qu'un tel phénomène puisse se produire dans notre modèle d'étude. La comparaison du protéome de fractions DIMs, purifiées à partir de cellules traitées ou non pendant 5 minutes à la cryptogéine a été réalisée à l'aide d'un marquage isotopique (15N ou 14N) et d'une approche de protéomique quantitative. Le premier résultat est que l'abondance de la majorité des protéines n'est pas modifiée dans les DIMs en réponse à la cryptogéine. Une seule protéine est enrichie dans les DIMs, une isoforme de 14-3-3, tandis que quatre dynamines (DRPs pour Dynamin Related Proteins), impliquées dans le trafic vésiculaire, sont exclues des DIMs en réponse à la cryptogéine. L'étude d'une des dynamines identifiées, DRP1A, a été menée. Nous avons caractérisé les différents gènes codant DRP1A dans le génome du tabac, puis utilisé une approche ARN antisens pour altérer l'expression de cette protéine et nous avons étudié sa localisation subcellulaire à l'aide d'anticorps spécifiques et en observant en microscopie confocale cette protéine fusionnée à la GFP. Cette approche a permis de confirmer la présence de DRP1A dans la fraction DIMs et la diminution transitoire de son association à cette fraction en réponse à la cryptogéine, suite à une dissociation de la fraction membranaire. Ces travaux constituent la première mise en évidence d'une association/dissociation dynamique de protéines aux DIMs de plantes en réponse à un stimulus biologique

La cryptogéine, une protéine sécrétée par l’oomycète Phytophthora cryptogea, provoque la mise en place de mécanismes de défense chez le tabac, mobilisant au cours des étapes précoces de la signalisation associée, des protéines localisées dans la membrane plasmique (MP). Une fraction membranaire résistante à la solubilisation par les détergents (DIM pour Detergent Insoluble Membrane), enrichie en stérols et en sphingolipides avait été purifiée à partir de la MP de tabac : cette fraction contenait plusieurs protéines impliquées dans la cascade de signalisation induite par la cryptogéine. Chez l’animal, l’association dynamique de protéines à des microdomaines riches en stérols et sphingolipides en réponse à un stress biotique joue un rôle essentiel dans la régulation de la signalisation cellulaire. L’objectif de ce travail était de tester l’hypothèse qu’un tel phénomène puisse se produire dans notre modèle d’étude. La comparaison du protéome de fractions DIMs, purifiées à partir de cellules traitées ou non pendant 5 minutes à la cryptogéine a été réalisée à l’aide d’un marquage isotopique (15N ou 14N) et d’une approche de protéomique quantitative. Le premier résultat est que l’abondance de la majorité des protéines n’est pas modifiée dans les DIMs en réponse à la cryptogéine. Une seule protéine est enrichie dans les DIMs, une isoforme de 14-3-3, tandis que quatre dynamines (DRPs pour Dynamin Related Proteins), impliquées dans le trafic vésiculaire, sont exclues des DIMs en réponse à la cryptogéine. L’étude d’une des dynamines identifiées, DRP1A, a été menée. Nous avons caractérisé les différents gènes codant DRP1A dans le génome du tabac, puis utilisé une approche ARN antisens pour altérer l’expression de cette protéine et nous avons étudié sa localisation subcellulaire à l’aide d’anticorps spécifiques et en observant en microscopie confocale cette protéine fusionnée à la GFP. Cette approche a permis de confirmer la présence de DRP1A dans la fraction DIMs et la diminution transitoire de son association à cette fraction en réponse à la cryptogéine, suite à une dissociation de la fraction membranaire. Ces travaux constituent la première mise en évidence d’une association/dissociation dynamique de protéines aux DIMs de plantes en réponse à un stimulus biologique / Cryptogein, a protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea, induces defense mechanisms in tobacco. Several proteins involved in the associated signaling pathway were identified and localized on the plasma membrane (PM). A fraction resistant to solubilization by detergent named DIMs for Detergent Insoluble Membranes, enriched in sterols an sphigolipids had been isolated from tobacco PM. It was proved to contain proteins previously identified as actors of the signaling cascade triggered by cryptogein. In animal cells, the dynamic association of proteins to sterol and sphingolipid rich microdomains under the influence of a biological stimulus plays an essential role in the regulation of cellular signaling. The purpose of this work was to test the hypothesis that such a phenomenon might occur in our model. The comparison using isotopic labeling (15N or 14N) and quantitative proteomics, of the composition of DIMs extracted from tobacco cells treated or not by cryptogein, revealed that, although the association to DIMs of most proteins remained unchanged, five proteins had their relative abundance modified after 5 minutes of treatment. One of these was a signaling protein (a 14-3-3 protein) and the four others were related to cell trafficking (4 DRPs, Dynamin Related Proteins). We characterized the DRP1A gene family in tobacco, and set up an antisens RNA antisense to down-regulate the expression of this protein. We studied the intracellular localization of DRP1 using specific antibodies and a GFP fusion. The results confirmed the presence of DRP1 in DIMs and its depletion from this fraction upon cryptogein treatment, through a dissociation from the PM. This is the first evidence of a dynamic association/dissociation of proteins to microdomains in plants upon a biological stimulus