京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第20440号 / 農博第2225号 / 新制||農||1049(附属図書館) / 学位論文||H29||N5061(農学部図書室) / 京都大学大学院農学研究科応用生命科学専攻 / (主査)教授 植田 充美, 教授 小川 順, 教授 渡邊 隆司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

La cryptogéine, une protéine sécrétée par l’oomycète Phytophthora cryptogea, provoque la mise en place de mécanismes de défense chez le tabac, mobilisant au cours des étapes précoces de la signalisation associée, des protéines localisées dans la membrane plasmique (MP). Une fraction membranaire résistante à la solubilisation par les détergents (DIM pour Detergent Insoluble Membrane), enrichie en stérols et en sphingolipides avait été purifiée à partir de la MP de tabac : cette fraction contenait plusieurs protéines impliquées dans la cascade de signalisation induite par la cryptogéine. Chez l’animal, l’association dynamique de protéines à des microdomaines riches en stérols et sphingolipides en réponse à un stress biotique joue un rôle essentiel dans la régulation de la signalisation cellulaire. L’objectif de ce travail était de tester l’hypothèse qu’un tel phénomène puisse se produire dans notre modèle d’étude. La comparaison du protéome de fractions DIMs, purifiées à partir de cellules traitées ou non pendant 5 minutes à la cryptogéine a été réalisée à l’aide d’un marquage isotopique (15N ou 14N) et d’une approche de protéomique quantitative. Le premier résultat est que l’abondance de la majorité des protéines n’est pas modifiée dans les DIMs en réponse à la cryptogéine. Une seule protéine est enrichie dans les DIMs, une isoforme de 14-3-3, tandis que quatre dynamines (DRPs pour Dynamin Related Proteins), impliquées dans le trafic vésiculaire, sont exclues des DIMs en réponse à la cryptogéine. L’étude d’une des dynamines identifiées, DRP1A, a été menée. Nous avons caractérisé les différents gènes codant DRP1A dans le génome du tabac, puis utilisé une approche ARN antisens pour altérer l’expression de cette protéine et nous avons étudié sa localisation subcellulaire à l’aide d’anticorps spécifiques et en observant en microscopie confocale cette protéine fusionnée à la GFP. Cette approche a permis de confirmer la présence de DRP1A dans la fraction DIMs et la diminution transitoire de son association à cette fraction en réponse à la cryptogéine, suite à une dissociation de la fraction membranaire. Ces travaux constituent la première mise en évidence d’une association/dissociation dynamique de protéines aux DIMs de plantes en réponse à un stimulus biologique / Cryptogein, a protein secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea, induces defense mechanisms in tobacco. Several proteins involved in the associated signaling pathway were identified and localized on the plasma membrane (PM). A fraction resistant to solubilization by detergent named DIMs for Detergent Insoluble Membranes, enriched in sterols an sphigolipids had been isolated from tobacco PM. It was proved to contain proteins previously identified as actors of the signaling cascade triggered by cryptogein. In animal cells, the dynamic association of proteins to sterol and sphingolipid rich microdomains under the influence of a biological stimulus plays an essential role in the regulation of cellular signaling. The purpose of this work was to test the hypothesis that such a phenomenon might occur in our model. The comparison using isotopic labeling (15N or 14N) and quantitative proteomics, of the composition of DIMs extracted from tobacco cells treated or not by cryptogein, revealed that, although the association to DIMs of most proteins remained unchanged, five proteins had their relative abundance modified after 5 minutes of treatment. One of these was a signaling protein (a 14-3-3 protein) and the four others were related to cell trafficking (4 DRPs, Dynamin Related Proteins). We characterized the DRP1A gene family in tobacco, and set up an antisens RNA antisense to down-regulate the expression of this protein. We studied the intracellular localization of DRP1 using specific antibodies and a GFP fusion. The results confirmed the presence of DRP1 in DIMs and its depletion from this fraction upon cryptogein treatment, through a dissociation from the PM. This is the first evidence of a dynamic association/dissociation of proteins to microdomains in plants upon a biological stimulus