Nas células cancerosas, a via apoptótica é danificada pela supressão ou mutação de genes importantes, como genes supressores de tumor p53 ou Check2. Isto faz com que as células cancerígenas percam a habilidade de executar a morte celular controlada, resultando na desobstrução da divisão celular e crescimento do tumor. Muitos tumores também mostram resistências aos tratamentos tradicionais como quimioterapia ou radioterapia. Tratamentos de câncer baseados na apoptose induzida ou em aumento na inibição das células cancerosas estão em desenvolvimento. O objetivo deste trabalho é investigar nas células cancerígenas humanas o efeito anti-proliferativo dos lipopeptídeos iturin A e fengycin obtidos das estirpes de Bacillus spp. bem como dos da proteina VP3 de Avian gyrovirus II (AGVII). A proteína VP3 do AGV II foi descoberta em 2011 e sua seqüência de aminoácido mostra 32.2% de homologia e domínios funcionas similares à proteina apoptina do vírus da anemia infecciosa das galinhas (CAV - apoptin), uma proteína que induz apoptose nas células cancerígenas mas que não afeta células normais. Inicialmente, para obter a proteína VP3 em uma análise adicional, a sequência PTD4, conhecida como uma sequência de transmissão dentro da célula, foi adicionada à seqüência VP3 através de PCR. Após a determinação da sequencia de nucleotideos, o produto de PCR foi clonado dentro do vetor de expressão PET-SUMO e a construção final foi transformada em E. coli BL21 (DE3) pLyS. Após a super expressão da proteína e a purificação subsequente, a proteína PTD4-VP3 foi incubada com culturas de células de câncer humano. Os lipopeptídeos iturin A e fengycin foram produzidos pelo Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 e pelo Bacillus sp. P34, respectivamente. Os lipopeptídeos foram purificados e adicionados às culturas de células de câncer humano. A linhagem de célula nãocancerígena humana AS405 (fibroblasto) foi escolhida como o controle. O efeito da proteína na viabilidade celular foi determinado através de testes de MTT. Os resultados mostraram que o efeito antiproliferativo dos lipopeptídeos utilizados iturin e fengycin, bem como os peptídeos virais PTD4-VP3 (T) e PTD4-VP3 (SM) dependem da dose. Para os lipopeptídeos o efeito de inibição do crescimento dependente do tempo, também pode ser detectada. Um efeito anti-proliferativo em células humanas normais não pode ser excluído, embora não tenha sido claramente demonstrado. Este é o primeiro estudo validando o 24 potencial anti-proliferativo dos lipopeptideos, iturin e fengycin e das proteínas de fusão viral PTD4-VP3 (T) e PTD4-VP3 (SM) em inibir o crescimento de células, principalmente células cancerígenas humanas. / In cancer cells the apoptotic pathway is damaged by deletion or mutation of important genes, e.g. tumor-suppressor gene p53 or Check2. This causes a loss in cancer cells to undergo controlled cell death resulting in unstopped cell division and tumor growth. Also, many tumors show resistances against the traditional applied treatments like chemo or radiation therapy. Therefore, accompanied or independent cancer treatments based on induced apoptosis or strengthened growth inhibition in cancer cells are under development. The objective of this work was to investigate the anti-proliferative effect on human cancer cells of the lipopeptides iturin A and fengycin obtained from strains of Bacillus spp. as well as of the Avian Gyrovirus II (AGVII) protein -VP3. The VP3 protein of the AGV II was discovered in 2011 and its amino acid sequence showed 32.2% homology and similar functional domains to the chicken anemia virus apoptin (CAV-apoptin), a protein that was proven to induce apoptosis in cancer cells but not in normal cells. Initially, to obtain the VP3 protein for further analysis, the PTD4 sequence, known as a transmission sequence into the cell, was N-terminally added to the VP3 sequence via PCR. After sequencing, the PCR product was cloned into the expression vector pET-SUMO and the final construct transformed into E. coli BL21(DE3)pLyS. After induced protein overexpression and subsequent purification, the PTD4-VP3 protein was quantified and incubated with human cancer-cell cultures. The lipopeptides iturin A and fengycin were produced by Bacillus amyloliquefaciens LBM 5006 and Bacillus sp. P34, respectively. The lipopeptides were purified and added to the cell cultures of human tumor cells. The human non-cancer cell line AS405 (skin fibroblasts) was chosen as control. The protein effect on cell viability was determined via MTT assays. The results showed that the lipopeptides iturin and fengycin as well as the viral peptides PTD4-VP3 (T) and PTD4- VP3 (SM) demonstrated dose-dependent anti-proliferative activity on cancer cells. For the lipopeptides also time-dependent growth-inhibition effect could be detected. A anti-proliferation effect on normal human cells was not excludable but could not clearly be demonstrated. 22 This is the first study validating the anti-proliferative potential of the lipopeptides iturin and fengycin and the viral fusion proteins PTD4-VP3 (T) and PTD4-VP3 (SM) to inhibit cell growth mainly in human cancer cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.lume.ufrgs.br:10183/117878 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Ditmer, Elisabeth M. |
| Contributors | Brandelli, Adriano |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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