Os neutrófilos são células fagocíticas do sistema imunológico mobilizadas principalmente no combate a infecções. Estas células são capazes de matar os micro-organismos através da desgranulação, que leva à liberação de moléculas antimicrobianas, e da produção de espécies reativas de oxigênio. Embora o recrutamento de neutrófilos seja essencial para a proteção do organismo, sua ativação excessiva resulta na intensa liberação de moléculas citotóxicas no meio extracelular, o que pode desencadear o desenvolvimento e/ou agravar o quadro clínico de doenças autoimunes e inflamatórias, como a artrite reumatoide. Uma possível abordagem terapêutica para o tratamento destas doenças é a modulação das funções efetoras dos neutrófilos. Estudos prévios mostraram que o extrato etanólico das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBd) possui grande potencial terapêutico, uma vez que apresenta expressiva atividade antioxidante frente ao metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Para dar continuidade à investigação da atividade anti-inflamatória e/ou imunomoduladora deste extrato, o presente trabalho avaliou, na primeira etapa, o seu efeito modulatório sobre importantes funções efetoras de neutrófilos que medeiam o reconhecimento a e eliminação de patógenos - fagocitose, desgranulação e atividade microbicida - e sobre a atividade de enzimas lisossomais. Verificou-se que o EEBd, dependendo da concentração, inibe o metabolismo oxidativo dos neutrófilos sem alterar a capacidade de defesa das células. Na segunda etapa, foi avaliada a atividade antioxidante de sete compostos isolados do EEBd - ácido cafeico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido cinâmico, aromadendrina-4?-metil éter, isosacuranetina e hispidulina - frente ao metabolismo oxidativo dos neutrófilos, a fim de propor possíveis marcadores químicos para as atividades biológicas do extrato. Os resultados apontaram o ácido cafeico como um potencial marcador químico da atividade biológica em questão. Na terceira etapa, com o intuito de aumentar a biodisponibilidade e favorecer o uso terapêutico dos produtos naturais estudados, o EEBd e o ácido cafeico foram incorporados em lipossomas, e constatou-se que a incorporação não alterou suas atividades antioxidantes frente aos neutrófilos, quando comparado às respectivas amostras na forma livre. Por fim, foi avaliado o efeito terapêutico do EEBd e do ácido cafeico, ambos na forma livre e incorporada em lipossomas, em um modelo animal de artrite. Verificou-se que as amostras na forma livre melhoraram expressivamente os parâmetros inflamatórios nas articulações, promovendo redução do edema e da migração de células totais e de neutrófilos, e discreta diminuição da concentração das citocinas inflamatórias TNF-?, IL-6 e IL-1?. Além disso, a incorporação do EEBd e do ácido cafeico em lipossomas pode auxiliar na redução das suas concentrações necessárias para a obtenção dos efeitos terapêuticos desejados. Assim, pode-se concluir que o EEBd tem grande potencial para se tornar um agente terapêutico adjuvante no tratamento de doenças inflamatórias mediadas por neutrófilos, sendo o ácido cafeico um possível marcador químico para a atividade anti-inflamatória do extrato. / Neutrophils are phagocytic immune cells mobilized primarily to fight against infections. These cells are capable to kill microorganisms through degranulation, which leads to the release of antimicrobial molecules, and production of reactive oxygen species. Although neutrophil recruitment is essential for host protection, excessive activation of these cells culminates in intense discharge of cytotoxic molecules to the extracellular milieu, which can elicit the development of and/or aggravate the clinical condition in autoimmune and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. Modulation of the effector functions of neutrophils is a possible therapeutic approach to treat these diseases. Previous studies have shown that the ethanolic extract of Baccharis dracunculifolia leaves (EEBd) has a great therapeutic potential due to its significant antioxidant effect towards the oxidative metabolism of neutrophils. To continue investigating the anti-inflammatory and/or immunomodulatory action of such extract, the first part of the present work examined its modulator effect on three important effector functions of human neutrophils that mediate recognition and clearance of pathogens - phagocytosis, degranulation, and microbial killing - and on the activity of lysosomal enzymes. EEBd inhibited the oxidative metabolism of neutrophils without affecting their defense ability, depending on the extract concentration used. To propose possible chemical markers for the biological effects of the extract, the second part of this study evaluated the antioxidant activity of seven compounds isolated from EEBd - caffeic acid, coumaric acid, ferulic acid, cinnamic acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin, and hispidulin - towards the oxidative metabolism of neutrophils. The results pointed to caffeic acid as a potential chemical marker for this biological activity. The third part of this investigation aimed to improve the bioavailability and favor the therapeutic use of the natural products studied. EEBd and caffeic acid were incorporated into liposomal carrier systems. The incorporation of both samples into liposomes did not alter their antioxidant activity towards neutrophils, as compared with their respective free forms. Finally, this study examined the therapeutic effect of EEBd and caffeic acid, both in the free form and incorporated into liposomes, in an animal model of arthritis. The free samples markedly improved the joint inflammatory parameters: they reduced edema and migration of total cells and neutrophils, and slightly lowered the levels of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor ? and interleukin 6 and 1? (TNF-?, IL-6, and IL-1?, respectively). In addition, incorporation of EEBd and caffeic acid into liposomes can help to reduce their concentrations required to achieve the desired therapeutic effect. Based on the set of results obtained in this study, we conclude that EEBd has a great potential to become a therapeutic adjuvant in the treatment of neutrophil-mediated inflammatory diseases, and that caffeic acid is a possible chemical marker of the anti-inflammatory activity of the extract.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-17112015-151553 |
| Date | 02 October 2015 |
| Creators | Andréa Silva Garcia de Figueiredo Rinhel |
| Contributors | Yara Maria Lucisano Valim, Marcelo Dias Baruffi, Fernando Batista da Costa, Carlos Alberto de Oliveira, Jose Mauricio Sforcin |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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