Os neutrófilos ou leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são células fagocíticas com funções bactericida e fungicida altamente potentes. A destruição dos microrganismos invasores é realizada através da liberação de substâncias tóxicas presentes em seus grânulos e das espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas durante o metabolismo oxidativo dessas células. Apesar dos benefícios da atividade antimicrobiana, em situações de intensa ativação celular, a grande produção e liberação de compostos citotóxicos podem causar efeitos deletérios sobre os tecidos do hospedeiro, como parece ocorrer em doenças por imunocomplexos. O grande potencial dos antioxidantes para o tratamento e prevenção dessas doenças tem levado à pesquisa de novos compostos que atuam no processo inflamatório em que estão envolvidos os neutrófilos ativados. Dentre estes, destacam-se os naturais, em que se encontra a planta Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), principal fonte botânica da própolis verde, sendo que a própolis possui diversas atividades biológicas conhecidas. Entretanto, a produção de metabólitos secundários pelas plantas pode ser modificada de acordo com fatores sazonais o que dificulta os estudos e pode acarretar em alterações de atividade biológica. Desta forma, este trabalho avaliou o efeito da sazonalidade no perfil químico de B. dracunculifolia e na atividade desta planta sobre o metabolismo oxidativo de PMNs. Para isso, extratos etanólicos brutos das folhas de B. dracunculifolia (EEBBd), colhidas mensalmente durante 14 meses foram submetidos à ensaios de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e avaliados quanto à capacidade de inibir a quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) produzida por PMNs estimulados. Além disso, para desvendar o(s) possível(is) mecanismo(s) de ação responsável(is) pela atividade antioxidante, foram realizados, com a amostra mais ativa em inibir a QL, ensaios para avaliar a citotoxicidade, a atividade scavenger de radicais livres (DPPH) e a ação sobre a atividade da enzima NADPH oxidase. Os resultados mostraram que todos os EEBBd inibiram tanto a QLlum quanto a QLluc de forma dependente da concentração e que para ambos os ensaios houve variação na eficiência deste efeito biológico ao longo do período de tempo estudado, demonstrando que a sazonalidade desempenhou um papel importante na intensidade da atividade antioxidante dos extratos. O ensaio de CLAE permitiu análise dos seguintes compostos: ácido caféico, ácido p-cumárico, aromadendrina-4-metil éter, isosakuranetina e artepilin C, e revelaram que apesar de não haver notória variação qualitativa entre os componentes, foi observada grande diferença quantitativa. As análises com a amostra do mês de maior atividade antioxidante (Maio/07) revelou que esta foi colhida durante um período de baixo índice pluviométrico, temperaturas amenas e apresentou a menor concentração da maioria dos compostos fenólicos estudados, evidenciando que tais compostos não foram os maiores responsáveis pela atividade biológica da amostra e que alguns desses compostos podem ter atuado como pró-oxidantes. Além disso, foi verificado que esta amostra atuou de forma não tóxica sobre as células, através da captação de parte das EROs geradas no meio reacional e de inibição parcial da atividade da NADPH oxidase. / Neutrophils or polymorphonuclear (PMN) are phagocytic cells with potent bactericidal and fungicidal functions. The destruction of invading microorganisms is made by the release of toxic substances contained within their granules and by the reactive oxygen species (ROS) produced during the oxidative metabolism of these cells. Despite the benefits of antimicrobial activity, in situations of intense cellular activation, large production and release of toxic compounds may cause deleterious effects on host tissue, as it seems to occur in immune complex diseases. The great potential of the antioxidants for the treatment and prevention of these diseases has led to the search of new compounds that act in the inflammatory process where are involved the activated neutrophils. Within this context, natural products are highlighted, mainly plants, among which is the Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), the main botanical source of green propolis, which has several activities already known. However, secondary metabolites of plants can be modified according to seasonal factors, what can difficult the studies and alter the biological activity results. Thus, this study evaluated the effect of seasonality in the chemical profile of B. dracunculifolia and in the activity of this plant on the oxidative metabolism of PMNs. For this, crude ethanolic extracts of B. dracunculifolia leaves (CEEBd), harvested monthly for 14 months were analyzed in high performance liquid chromatography (HPLC) and evaluated for their ability to inhibit the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence (CLlum and CLluc, respectively) produced by stimulated PMNs. In addiction, to understand the possible mechanisms of action responsible for antioxidant effect, the most active sample in the CL test was evaluated for the following proprieties: cytotoxic, scavenger of free radicals (DPPH) and action on the NADPH oxidase activity. The results showed that all CEEBd inhibited both CLlum and CLluc in a concentration-dependent manner and that in both trials it was found variation in the biological effect over the study period, indicating that the seasonality played an important role on the intensity of the antioxidant activity of the extracts. The HPLC assay allowed the analysis of the following compounds: caffeic acid, p-coumaric acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin and artepillin C, and showed that although there was no evident variation in qualitative profile, it was observed large quantitative differences. The analysis of the sample of greatest antioxidant activity (May/07) revealed that it was harvested during a period of low rainfall, mild temperatures and had lower concentrations of most compounds studied, indicating that these compounds were not the most responsible for the biological activity of the sample and that some of these substances may have acted as pro-oxidants molecules. Furthermore, it was found that this sample works in a non-toxic manner on cells, by capturing some of the ROS generated in the reaction medium and by partial inhibition of NADPH oxidase activity.

Os neutrófilos ou leucócitos polimorfonucleares (PMNs) são células fagocíticas com funções bactericida e fungicida altamente potentes. A destruição dos microrganismos invasores é realizada através da liberação de substâncias tóxicas presentes em seus grânulos e das espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas durante o metabolismo oxidativo dessas células. Apesar dos benefícios da atividade antimicrobiana, em situações de intensa ativação celular, a grande produção e liberação de compostos citotóxicos podem causar efeitos deletérios sobre os tecidos do hospedeiro, como parece ocorrer em doenças por imunocomplexos. O grande potencial dos antioxidantes para o tratamento e prevenção dessas doenças tem levado à pesquisa de novos compostos que atuam no processo inflamatório em que estão envolvidos os neutrófilos ativados. Dentre estes, destacam-se os naturais, em que se encontra a planta Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), principal fonte botânica da própolis verde, sendo que a própolis possui diversas atividades biológicas conhecidas. Entretanto, a produção de metabólitos secundários pelas plantas pode ser modificada de acordo com fatores sazonais o que dificulta os estudos e pode acarretar em alterações de atividade biológica. Desta forma, este trabalho avaliou o efeito da sazonalidade no perfil químico de B. dracunculifolia e na atividade desta planta sobre o metabolismo oxidativo de PMNs. Para isso, extratos etanólicos brutos das folhas de B. dracunculifolia (EEBBd), colhidas mensalmente durante 14 meses foram submetidos à ensaios de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e avaliados quanto à capacidade de inibir a quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e de lucigenina (QLluc) produzida por PMNs estimulados. Além disso, para desvendar o(s) possível(is) mecanismo(s) de ação responsável(is) pela atividade antioxidante, foram realizados, com a amostra mais ativa em inibir a QL, ensaios para avaliar a citotoxicidade, a atividade scavenger de radicais livres (DPPH) e a ação sobre a atividade da enzima NADPH oxidase. Os resultados mostraram que todos os EEBBd inibiram tanto a QLlum quanto a QLluc de forma dependente da concentração e que para ambos os ensaios houve variação na eficiência deste efeito biológico ao longo do período de tempo estudado, demonstrando que a sazonalidade desempenhou um papel importante na intensidade da atividade antioxidante dos extratos. O ensaio de CLAE permitiu análise dos seguintes compostos: ácido caféico, ácido p-cumárico, aromadendrina-4-metil éter, isosakuranetina e artepilin C, e revelaram que apesar de não haver notória variação qualitativa entre os componentes, foi observada grande diferença quantitativa. As análises com a amostra do mês de maior atividade antioxidante (Maio/07) revelou que esta foi colhida durante um período de baixo índice pluviométrico, temperaturas amenas e apresentou a menor concentração da maioria dos compostos fenólicos estudados, evidenciando que tais compostos não foram os maiores responsáveis pela atividade biológica da amostra e que alguns desses compostos podem ter atuado como pró-oxidantes. Além disso, foi verificado que esta amostra atuou de forma não tóxica sobre as células, através da captação de parte das EROs geradas no meio reacional e de inibição parcial da atividade da NADPH oxidase. / Neutrophils or polymorphonuclear (PMN) are phagocytic cells with potent bactericidal and fungicidal functions. The destruction of invading microorganisms is made by the release of toxic substances contained within their granules and by the reactive oxygen species (ROS) produced during the oxidative metabolism of these cells. Despite the benefits of antimicrobial activity, in situations of intense cellular activation, large production and release of toxic compounds may cause deleterious effects on host tissue, as it seems to occur in immune complex diseases. The great potential of the antioxidants for the treatment and prevention of these diseases has led to the search of new compounds that act in the inflammatory process where are involved the activated neutrophils. Within this context, natural products are highlighted, mainly plants, among which is the Baccharis dracunculifolia (Asteraceae), the main botanical source of green propolis, which has several activities already known. However, secondary metabolites of plants can be modified according to seasonal factors, what can difficult the studies and alter the biological activity results. Thus, this study evaluated the effect of seasonality in the chemical profile of B. dracunculifolia and in the activity of this plant on the oxidative metabolism of PMNs. For this, crude ethanolic extracts of B. dracunculifolia leaves (CEEBd), harvested monthly for 14 months were analyzed in high performance liquid chromatography (HPLC) and evaluated for their ability to inhibit the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence (CLlum and CLluc, respectively) produced by stimulated PMNs. In addiction, to understand the possible mechanisms of action responsible for antioxidant effect, the most active sample in the CL test was evaluated for the following proprieties: cytotoxic, scavenger of free radicals (DPPH) and action on the NADPH oxidase activity. The results showed that all CEEBd inhibited both CLlum and CLluc in a concentration-dependent manner and that in both trials it was found variation in the biological effect over the study period, indicating that the seasonality played an important role on the intensity of the antioxidant activity of the extracts. The HPLC assay allowed the analysis of the following compounds: caffeic acid, p-coumaric acid, aromadendrin-4\'-methyl ether, isosakuranetin and artepillin C, and showed that although there was no evident variation in qualitative profile, it was observed large quantitative differences. The analysis of the sample of greatest antioxidant activity (May/07) revealed that it was harvested during a period of low rainfall, mild temperatures and had lower concentrations of most compounds studied, indicating that these compounds were not the most responsible for the biological activity of the sample and that some of these substances may have acted as pro-oxidants molecules. Furthermore, it was found that this sample works in a non-toxic manner on cells, by capturing some of the ROS generated in the reaction medium and by partial inhibition of NADPH oxidase activity.

O uso de enxaguatórios bucais contendo substâncias ativas antimicrobianas tem sido proposto como um importante meio de redução da formação de biofilme dental supragengival quando usados concomitantemente com higienização mecânica da cavidade bucal. A microemulsão é um moderno sistema de liberação de fármacos, que pode solubilizar tanto compostos lipo quanto hidrossolúveis. Foi demonstrado que extratos de Baccharis dracunculifolia (Bd), popularmente conhecido como alecrim-do-campo apresentaram atividade anticariogênica, sugerindo sua utilização em produtos para higiene bucal. No entanto, o extrato de Baccharis dracunculifolia é pouco solúvel em água. No presente trabalho, nós desenvolvemos e caracterizamos microemulsões com extrato e óleo essencial das folhas de Bd para incorporar em formulação de enxaguatório bucal sem álcool, com finalidades preventiva e terapêutica, contendo extrato hidroetanólico e óleo essencial das folhas de Baccharis dracunculifolia e avaliar o seu efeito sobre fatores de virulência de Streptococcus mutans (S. mutans) in vitro. Foram obtidos 4 diagramas de fase pseudo-ternário: 1. Labrasol® (L-polietilenoglicol-8-caprilato/caprato)/Plurol® (P-isoestearato de poligliceril) (3:1)/Oleato Etila - (LP); 2. PEG 40 (óleo de rícino hidrogenado e etoxilado)/Sorbitol (2:1)/ Oleato de etila - (PSO); 3. PEG 40/Sorbitol (2:1)/Miristato de isoropila - (PSM) e 4. PEG 40/Sorbitol/Glicerol (1:1:1)/Oleato de etila e óleo essencial de B. dracunculifolia - (PSG). Os sistemas foram caracterizados (microscopia óptica, estabilidade preliminar, reologia, pH, tamanho de gotículas, viscosidade, condutividade elétrica, densidade relativa e índice de refração). Foram desenvolvidas 4 formulações enxaguatórias com a microemulsão escolhida e submetidas à análise sensorial por teste de preferência. O efeito do enxaguatório bucal contendo o extrato hidroetanólico e óleo essencial de B. dracunculifolia foi avaliado in vitro, sobre fatores cariogênicos de S. mutans: inibição do potencial acidogênico, concentração inibitória mínima (CIM) e influência no perfil de crescimento. Além disso, foram avaliados citotoxicidade por MTT e capacidade de manchamento de dentes de estoque pelo padrão CIELAB do enxaguatório bucal. O sistema microemulsionado escolhido apresentou as seguintes propriedades físico-químicas: viscosidade de 12,40 cP, tamanho de gotícula 19,53 nm, condutividade 204,63 µS/cm, pH final 4,95, densidade relativa 1,0394g/mL, índice de refração igual a 1,3595. A formulação escolhida para desenvolver o enxaguatório bucal, apresenta pH final igual a 5,89, densidade igual a 1,0425 g/mL, índice de refração de 1,3614 e viscosidade igual a 12,0 cP. O enxaguatório bucal apresentou atividade inibitória sobre a produção bacteriana de ácidos, com valor de CI50 igual a 128 µg de extrato bruto/mL da formulação, apresentando CIM (Concentração Inibitória Mínima) igual a 400 g de extrato bruto/mL da formulação, para uma concentração final de inóculo igual a 5 x 103 ufc/mL. Na avaliação de mudança de coloração dos dentes, o enxaguatório bucal de referência Periogard® (contendo digluconato de clorexidina 0,12%) e o enxaguatório de B. dracunculifolia apresentaram valores de E iguais a 2,62 e 0,55 unidades CIELAB, respectivamente, evidenciando que o primeiro mancha os dentes e o segundo não, mas que os dois são clinicamente aceitáveis. Além disso, enxaguatorio bucal contendo extrato e óleo essencial de B. dracunculifolia apresenta baixa interferência na proliferação celular, por teste de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium). Os resultados sugerem que a formulação final escolhida possui propriedades antimicrobianas superiores ao extrato hidroetanólico bruto, com baixo efeito citotóxico, credenciando-o para avaliação clínica. / The use of antimicrobial mouthrinses to help the plaques supragengival control and gingivitis has been shown to significantly contribute to patients daily oral hygiene. Formulations based on microemulsions have several interesting characteristics such as the ability to protect labile drugs, their release control, and to increase their solubility and bioavailability. It has been demonstrated that extracts from Baccharis dracunculifolia (Bd), a Brazilian shrub species, popularly known as alecrim-do-campo, show anticariogenic properties, which suggests its appliance into oral care products. However, Baccharis dracunculifolia extracts are poorly water soluble. In this work, we have developed and characterized microemulsions in which Baccharis dracunculifolia extract and essential oil may be incorporated to produce a clear solution in an alcohol-free mouthrinse. Four Bd extract - containing microemulsion systems (1) ethyl oleate/Labrasol®/Plurol® (LP), (2) isopropyl miristate/PEG 40/Sorbytol (PSM), (3) ethyl oleate/PEG 40/Sorbytol (PSO) and (4) ethyl oleate/Baccharis dracunculifolia extract/essencial oil/PEG 40/Sorbytol/Glycerol (PSG), were prepared in aqueous mixtures at room temperature, using the conventional titration technique. The pseudo-ternary phase diagrams were prepared at room temperature. The systems were characterized by optical microscopy, preliminary stability, rheology, pH, droplet size, electrical conductivity, relative density, viscosity and refractive index. The inhibitory effect on bacterial acid production was evaluated through the potentiometric measurement of pH from bacterial suspensions treated with serial concentrations of Bd mouthrinse (16 - 400 µg/mL). For the antibacterial activity assay, the inhibitory effect on bacterial growth and the minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined. Bd mouthrinses four formulations sensory analysis was evaluated at preference test. The citotoxicity was evaluated by MTT method and staining potential was measured by CIELAB standart. Two regions were identified in the first diagram (bifasic system and microemulsion) while three regions were identified on the others (bifasic system, emulsion and microemulsion). All systems displayed an oil-in-water microemulsion region. The system chosen for the mouthrinse presented viscosity (12.40 cP), droplet size (19.53nm), conductivity (204.63 S/cm), pH (4.95), relative density (1.0394g/mL) and refractive index (1.3595). The chosen mouthrinse presented viscosity (12.00 cP), droplet size (19.53nm), final pH (5.89), relative density (1.0425g/mL) and refractive index (1.3614). The mouthrinse displayed inhibitory effects upon S. mutans virulence factors. The IC50 value for the inhibitory effect on the bacterial acid production was 128 µg/mL. The MIC value was 400µg/mL. Bd mouthrinse tested by the agar diffusion method, was not displayed growth inhibition. The acrylic resin teeth stainability test displayed E values of 2.62 CIELAB units for the reference mouthrinse (Periogard®) and 0,55 for Bd mouthrinse. According to results, the reference mouthrinse (Periogard®) causes resin acrylic teeth color variation while Bd mouthrinse did not cause teeth staining or cytotoxicity by MTT method. The Results indicate that these systems could be an interesting Bd vehicle for a mouthrinse and suggest that the final rising formulation has antimicrobial properties superior to the rough hydroetanolic extract, with low cytotoxic effect, turning it credible to clinical evaluation.

Os neutrófilos representam a primeira linha de defesa do hospedeiro, atuando na contenção e eliminação de patógenos. Contudo, alterações na vida média, no excessivo recrutamento e ativação dos neutrófilos estão associados a danos teciduais e a doenças inflamatórias e autoimunes. A modulação das funções efetoras dos neutrófilos pode auxiliar no tratamento de tais patologias. Neste sentido, os produtos naturais constituem uma importante fonte de novas substâncias imunomoduladoras. Um estudo recente demonstrou que, a inibição do metabolismo oxidativo de neutrófilos pelo extrato etanólico bruto das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBBd) correlaciona-se com a proporção entre ácido cafeico (CaA) e outros compostos fenólicos contidos nesta amostra. Para dar prosseguimento à investigação do potencial imunomodulador do EEBBd e do CaA, os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito modulador desses produtos naturais: (i) em três funções efetoras de neutrófilos humanos - fagocitose, atividade microbicida e metabolismo oxidativo estimulado por agentes independentes de receptores (forbol-12-miristato-13-acetato; PMA) e dependentes apenas de receptores Fcgama (imunocomplexos não-opsonizados; IC) ou de receptores Fcgama associados a receptores do complemento (imunocomplexos opsonizados com complemento; IC-SHN); (ii) na atividade da mieloperoxidase (MPO); (iii) na expressão de receptores de membrana; (iv) e na captura (scavenger) de H2O2 e HOCl. O CaA foi mais efetivo do que o EEBBd em inibir a atividade da MPO e em capturar H2O2 e HOCl. A análise in silico revelou que o CaA bloqueia a entrada do sítio ativo da MPO através da interação com os resíduos Gln-91, His-95 e Arg-239; os dois últimos resíduos são essenciais para clivar o H2O2 e para estabilizar o sítio ativo, respectivamente. A eficiência dos agentes utilizados para estimular o metabolismo oxidativo, medido por quimioluminescência dependente de lucigenina e de luminol, ocorreu na seguinte ordem: PMA > IC-SHN > IC. Embora o PMA tenha sido o agente mais efetivo em estimular o metabolismo oxidativo, ambas as amostras (EEBBd e CaA) inibiram com maior intensidade esta função celular estimulada por PMA do que a mesma função estimulada por IC-SHN e IC. Além disso, ambas, EEBBd e CaA, não alteraram os níveis de expressão dos receptores TLR2, TLR4, CD16, CD32, e CD11b/CD18. Nas maiores concentrações avaliadas, EEBBd (50 ug/mL) e CaA (90 ug/mL) não foram citotóxicos para os neutrófilos. O EEBBd inibiu intensamente a capacidade fagocítica e reduziu discretamente a capacidade microbicida dos neutrófilos frente à Candida albicans. Portanto, o CaA contribui para ação inibitória do EEBBd no metabolismo oxidativo e na atividade da MPO, mas não na capacidade fagocítica e microbicida de neutrófilos. Por fim, o efeito imunomodulador do CaA e do EEBBd não é mediado por alterações na viabilidade celular ou na expressão de receptores de membrana em neutrófilos. O conjunto de resultados obtidos pode auxiliar na elucidação do mecanismo de ação destes produtos naturais sobre as funções efetoras de neutrófilos, bem como no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias mediadas pela ativação exacerbada de neutrófilos. / Neutrophils represent the first line of host defense that acts in the containment and clearance of pathogens. However, changes in life span and excessive recruitment and activation of neutrophils are associated with tissue damage and inflammatory and autoimmune diseases. Modulation of the effector functions of neutrophils can help to treat these pathologies. In this sense, natural products constitute an important source of novel immunomodulating compounds. A recent study has demonstrated that the neutrophil oxidative metabolism inhibition by the crude ethanol extract of Baccharis dracunculifolia (EEBBd) leaves correlates with the ratio of caffeic acid (CaA) to other phenolic compounds that exist in it. To continue investigating the immunomodulating potential of EEBBd and CaA, the present study aimed to examine whether these natural products modulate: (i) three effector functions of human neutrophils phagocytosis, microbial killing, and oxidative metabolism elicited by a receptor-independent stimulus (phorbol-12-myristate-13-acetate; PMA) and by receptor-dependent stimuli that bind Fcgama receptors alone (non-opsonized immune complexes; IC) or in combination with complement receptors (complement-opsonized immune complexes; IC-SHN); (ii) myeloperoxidase (MPO) activity; (iii) expression of membrane receptors; (iv) H2O2 e HOCl scavenging. CaA was more effective than EEBBd in inhibiting MPO activity and scavenging H2O2 and HOCl. The in silico analysis revealed that CaA blocks the entrance of the active site of MPO through the interaction with Gln-91, His-95, and Arg-239; the two last residues are essential to cleave H2O2 and stabilize the active site, respectively. The agents used to stimulate the oxidative metabolism, as measured by the lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence assays, acted in the following ranking order of efficiency: PMA > IC-SHN > IC. Although PMA was the most efficient agent at stimulating the neutrophil oxidative metabolism, both samples (EEBBd and CaA) suppressed the PMA-induced oxidative metabolism more effectively than they suppressed the same cell function elicited by IC-SHN and IC. Both EEBBd and CaA did not alter the levels of TLR2, TLR4, CD16, CD32, and CD11b/CD18 receptors expression. At the highest concentrations tested, EEBBd (50 ug/mL) and CaA (90 ug/mL) were not toxic towards neutrophils. EEBBd strongly diminished the phagocytic capacity and slightly reduced the Candida albicans killing ability of neutrophils. In conclusion, CaA contributes to the EEBBd inhibitory action on the oxidative metabolism and MPO activity but not on the phagocytic capacity and microbial killing ability of neutrophils. Furthermore, the immunomodulating effect of CaA and EEBBd is not mediated by alterations in either cell viability or expression of membrane receptors in neutrophils. Together, the results can help to unravel the mechanism of action of these natural products on the effector functions of neutrophils, and to develop new drugs to treat inflammatory diseases mediated by neutrophil overactivation.

O uso de enxaguatórios bucais contendo substâncias ativas antimicrobianas tem sido proposto como um importante meio de redução da formação de biofilme dental supragengival quando usados concomitantemente com higienização mecânica da cavidade bucal. A microemulsão é um moderno sistema de liberação de fármacos, que pode solubilizar tanto compostos lipo quanto hidrossolúveis. Foi demonstrado que extratos de Baccharis dracunculifolia (Bd), popularmente conhecido como alecrim-do-campo apresentaram atividade anticariogênica, sugerindo sua utilização em produtos para higiene bucal. No entanto, o extrato de Baccharis dracunculifolia é pouco solúvel em água. No presente trabalho, nós desenvolvemos e caracterizamos microemulsões com extrato e óleo essencial das folhas de Bd para incorporar em formulação de enxaguatório bucal sem álcool, com finalidades preventiva e terapêutica, contendo extrato hidroetanólico e óleo essencial das folhas de Baccharis dracunculifolia e avaliar o seu efeito sobre fatores de virulência de Streptococcus mutans (S. mutans) in vitro. Foram obtidos 4 diagramas de fase pseudo-ternário: 1. Labrasol® (L-polietilenoglicol-8-caprilato/caprato)/Plurol® (P-isoestearato de poligliceril) (3:1)/Oleato Etila - (LP); 2. PEG 40 (óleo de rícino hidrogenado e etoxilado)/Sorbitol (2:1)/ Oleato de etila - (PSO); 3. PEG 40/Sorbitol (2:1)/Miristato de isoropila - (PSM) e 4. PEG 40/Sorbitol/Glicerol (1:1:1)/Oleato de etila e óleo essencial de B. dracunculifolia - (PSG). Os sistemas foram caracterizados (microscopia óptica, estabilidade preliminar, reologia, pH, tamanho de gotículas, viscosidade, condutividade elétrica, densidade relativa e índice de refração). Foram desenvolvidas 4 formulações enxaguatórias com a microemulsão escolhida e submetidas à análise sensorial por teste de preferência. O efeito do enxaguatório bucal contendo o extrato hidroetanólico e óleo essencial de B. dracunculifolia foi avaliado in vitro, sobre fatores cariogênicos de S. mutans: inibição do potencial acidogênico, concentração inibitória mínima (CIM) e influência no perfil de crescimento. Além disso, foram avaliados citotoxicidade por MTT e capacidade de manchamento de dentes de estoque pelo padrão CIELAB do enxaguatório bucal. O sistema microemulsionado escolhido apresentou as seguintes propriedades físico-químicas: viscosidade de 12,40 cP, tamanho de gotícula 19,53 nm, condutividade 204,63 µS/cm, pH final 4,95, densidade relativa 1,0394g/mL, índice de refração igual a 1,3595. A formulação escolhida para desenvolver o enxaguatório bucal, apresenta pH final igual a 5,89, densidade igual a 1,0425 g/mL, índice de refração de 1,3614 e viscosidade igual a 12,0 cP. O enxaguatório bucal apresentou atividade inibitória sobre a produção bacteriana de ácidos, com valor de CI50 igual a 128 µg de extrato bruto/mL da formulação, apresentando CIM (Concentração Inibitória Mínima) igual a 400 g de extrato bruto/mL da formulação, para uma concentração final de inóculo igual a 5 x 103 ufc/mL. Na avaliação de mudança de coloração dos dentes, o enxaguatório bucal de referência Periogard® (contendo digluconato de clorexidina 0,12%) e o enxaguatório de B. dracunculifolia apresentaram valores de E iguais a 2,62 e 0,55 unidades CIELAB, respectivamente, evidenciando que o primeiro mancha os dentes e o segundo não, mas que os dois são clinicamente aceitáveis. Além disso, enxaguatorio bucal contendo extrato e óleo essencial de B. dracunculifolia apresenta baixa interferência na proliferação celular, por teste de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium). Os resultados sugerem que a formulação final escolhida possui propriedades antimicrobianas superiores ao extrato hidroetanólico bruto, com baixo efeito citotóxico, credenciando-o para avaliação clínica. / The use of antimicrobial mouthrinses to help the plaques supragengival control and gingivitis has been shown to significantly contribute to patients daily oral hygiene. Formulations based on microemulsions have several interesting characteristics such as the ability to protect labile drugs, their release control, and to increase their solubility and bioavailability. It has been demonstrated that extracts from Baccharis dracunculifolia (Bd), a Brazilian shrub species, popularly known as alecrim-do-campo, show anticariogenic properties, which suggests its appliance into oral care products. However, Baccharis dracunculifolia extracts are poorly water soluble. In this work, we have developed and characterized microemulsions in which Baccharis dracunculifolia extract and essential oil may be incorporated to produce a clear solution in an alcohol-free mouthrinse. Four Bd extract - containing microemulsion systems (1) ethyl oleate/Labrasol®/Plurol® (LP), (2) isopropyl miristate/PEG 40/Sorbytol (PSM), (3) ethyl oleate/PEG 40/Sorbytol (PSO) and (4) ethyl oleate/Baccharis dracunculifolia extract/essencial oil/PEG 40/Sorbytol/Glycerol (PSG), were prepared in aqueous mixtures at room temperature, using the conventional titration technique. The pseudo-ternary phase diagrams were prepared at room temperature. The systems were characterized by optical microscopy, preliminary stability, rheology, pH, droplet size, electrical conductivity, relative density, viscosity and refractive index. The inhibitory effect on bacterial acid production was evaluated through the potentiometric measurement of pH from bacterial suspensions treated with serial concentrations of Bd mouthrinse (16 - 400 µg/mL). For the antibacterial activity assay, the inhibitory effect on bacterial growth and the minimum inhibitory concentrations (MIC) were determined. Bd mouthrinses four formulations sensory analysis was evaluated at preference test. The citotoxicity was evaluated by MTT method and staining potential was measured by CIELAB standart. Two regions were identified in the first diagram (bifasic system and microemulsion) while three regions were identified on the others (bifasic system, emulsion and microemulsion). All systems displayed an oil-in-water microemulsion region. The system chosen for the mouthrinse presented viscosity (12.40 cP), droplet size (19.53nm), conductivity (204.63 S/cm), pH (4.95), relative density (1.0394g/mL) and refractive index (1.3595). The chosen mouthrinse presented viscosity (12.00 cP), droplet size (19.53nm), final pH (5.89), relative density (1.0425g/mL) and refractive index (1.3614). The mouthrinse displayed inhibitory effects upon S. mutans virulence factors. The IC50 value for the inhibitory effect on the bacterial acid production was 128 µg/mL. The MIC value was 400µg/mL. Bd mouthrinse tested by the agar diffusion method, was not displayed growth inhibition. The acrylic resin teeth stainability test displayed E values of 2.62 CIELAB units for the reference mouthrinse (Periogard®) and 0,55 for Bd mouthrinse. According to results, the reference mouthrinse (Periogard®) causes resin acrylic teeth color variation while Bd mouthrinse did not cause teeth staining or cytotoxicity by MTT method. The Results indicate that these systems could be an interesting Bd vehicle for a mouthrinse and suggest that the final rising formulation has antimicrobial properties superior to the rough hydroetanolic extract, with low cytotoxic effect, turning it credible to clinical evaluation.

Os neutrófilos representam a primeira linha de defesa do hospedeiro, atuando na contenção e eliminação de patógenos. Contudo, alterações na vida média, no excessivo recrutamento e ativação dos neutrófilos estão associados a danos teciduais e a doenças inflamatórias e autoimunes. A modulação das funções efetoras dos neutrófilos pode auxiliar no tratamento de tais patologias. Neste sentido, os produtos naturais constituem uma importante fonte de novas substâncias imunomoduladoras. Um estudo recente demonstrou que, a inibição do metabolismo oxidativo de neutrófilos pelo extrato etanólico bruto das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBBd) correlaciona-se com a proporção entre ácido cafeico (CaA) e outros compostos fenólicos contidos nesta amostra. Para dar prosseguimento à investigação do potencial imunomodulador do EEBBd e do CaA, os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito modulador desses produtos naturais: (i) em três funções efetoras de neutrófilos humanos - fagocitose, atividade microbicida e metabolismo oxidativo estimulado por agentes independentes de receptores (forbol-12-miristato-13-acetato; PMA) e dependentes apenas de receptores Fcgama (imunocomplexos não-opsonizados; IC) ou de receptores Fcgama associados a receptores do complemento (imunocomplexos opsonizados com complemento; IC-SHN); (ii) na atividade da mieloperoxidase (MPO); (iii) na expressão de receptores de membrana; (iv) e na captura (scavenger) de H2O2 e HOCl. O CaA foi mais efetivo do que o EEBBd em inibir a atividade da MPO e em capturar H2O2 e HOCl. A análise in silico revelou que o CaA bloqueia a entrada do sítio ativo da MPO através da interação com os resíduos Gln-91, His-95 e Arg-239; os dois últimos resíduos são essenciais para clivar o H2O2 e para estabilizar o sítio ativo, respectivamente. A eficiência dos agentes utilizados para estimular o metabolismo oxidativo, medido por quimioluminescência dependente de lucigenina e de luminol, ocorreu na seguinte ordem: PMA > IC-SHN > IC. Embora o PMA tenha sido o agente mais efetivo em estimular o metabolismo oxidativo, ambas as amostras (EEBBd e CaA) inibiram com maior intensidade esta função celular estimulada por PMA do que a mesma função estimulada por IC-SHN e IC. Além disso, ambas, EEBBd e CaA, não alteraram os níveis de expressão dos receptores TLR2, TLR4, CD16, CD32, e CD11b/CD18. Nas maiores concentrações avaliadas, EEBBd (50 ug/mL) e CaA (90 ug/mL) não foram citotóxicos para os neutrófilos. O EEBBd inibiu intensamente a capacidade fagocítica e reduziu discretamente a capacidade microbicida dos neutrófilos frente à Candida albicans. Portanto, o CaA contribui para ação inibitória do EEBBd no metabolismo oxidativo e na atividade da MPO, mas não na capacidade fagocítica e microbicida de neutrófilos. Por fim, o efeito imunomodulador do CaA e do EEBBd não é mediado por alterações na viabilidade celular ou na expressão de receptores de membrana em neutrófilos. O conjunto de resultados obtidos pode auxiliar na elucidação do mecanismo de ação destes produtos naturais sobre as funções efetoras de neutrófilos, bem como no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias mediadas pela ativação exacerbada de neutrófilos. / Neutrophils represent the first line of host defense that acts in the containment and clearance of pathogens. However, changes in life span and excessive recruitment and activation of neutrophils are associated with tissue damage and inflammatory and autoimmune diseases. Modulation of the effector functions of neutrophils can help to treat these pathologies. In this sense, natural products constitute an important source of novel immunomodulating compounds. A recent study has demonstrated that the neutrophil oxidative metabolism inhibition by the crude ethanol extract of Baccharis dracunculifolia (EEBBd) leaves correlates with the ratio of caffeic acid (CaA) to other phenolic compounds that exist in it. To continue investigating the immunomodulating potential of EEBBd and CaA, the present study aimed to examine whether these natural products modulate: (i) three effector functions of human neutrophils phagocytosis, microbial killing, and oxidative metabolism elicited by a receptor-independent stimulus (phorbol-12-myristate-13-acetate; PMA) and by receptor-dependent stimuli that bind Fcgama receptors alone (non-opsonized immune complexes; IC) or in combination with complement receptors (complement-opsonized immune complexes; IC-SHN); (ii) myeloperoxidase (MPO) activity; (iii) expression of membrane receptors; (iv) H2O2 e HOCl scavenging. CaA was more effective than EEBBd in inhibiting MPO activity and scavenging H2O2 and HOCl. The in silico analysis revealed that CaA blocks the entrance of the active site of MPO through the interaction with Gln-91, His-95, and Arg-239; the two last residues are essential to cleave H2O2 and stabilize the active site, respectively. The agents used to stimulate the oxidative metabolism, as measured by the lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence assays, acted in the following ranking order of efficiency: PMA > IC-SHN > IC. Although PMA was the most efficient agent at stimulating the neutrophil oxidative metabolism, both samples (EEBBd and CaA) suppressed the PMA-induced oxidative metabolism more effectively than they suppressed the same cell function elicited by IC-SHN and IC. Both EEBBd and CaA did not alter the levels of TLR2, TLR4, CD16, CD32, and CD11b/CD18 receptors expression. At the highest concentrations tested, EEBBd (50 ug/mL) and CaA (90 ug/mL) were not toxic towards neutrophils. EEBBd strongly diminished the phagocytic capacity and slightly reduced the Candida albicans killing ability of neutrophils. In conclusion, CaA contributes to the EEBBd inhibitory action on the oxidative metabolism and MPO activity but not on the phagocytic capacity and microbial killing ability of neutrophils. Furthermore, the immunomodulating effect of CaA and EEBBd is not mediated by alterations in either cell viability or expression of membrane receptors in neutrophils. Together, the results can help to unravel the mechanism of action of these natural products on the effector functions of neutrophils, and to develop new drugs to treat inflammatory diseases mediated by neutrophil overactivation.

Atualmente, há uma considerável quantidade de informações relativas a aspectos químicos e biológicos da própolis, porém sua aplicação terapêutica ainda pode ser considerada incipiente. Isto se deve, principalmente, a grande variabilidade da composição química deste produto em função de sua origem geográfica/botânica, já que em diferentes ecossistemas as abelhas recorrem a distintas espécies vegetais como fontes de matérias-primas para sua elaboração. Desta forma, para se chegar a uma futura padronização, os conhecimentos da(s) fonte(s) botânica(s) e da origem geográfica da amostra são fundamentais e devem acompanhar qualquer estudo biológico, no sentido de se estabelecer quais atividades biológicas correspondem a um tipo específico de própolis. O presente trabalho objetiva contribuir para os conhecimentos da composição de própolis do estado de São Paulo (coletado na Serra do Japi) e de sua fonte botânica, bem como para a discussão dos possíveis mecanismos envolvidos em processos de cicatrização, influenciados pela aplicação tópica de própolis (um de seus usos mais difundidos mundialmente é como \"cicatrizante\"). Para tanto, traz análises físico-químicas, preconizadas pelo Ministério da Agricultura (teores de cinzas, cera, sólidos solúveis, flavonóides e fenóis totais, perda por dessecação a 105 ºC e massa mecânica), estudos de composição química pela técnica CLAE, análises cromatográficas comparativas entre o extrato metanólico de própolis e de sua suposta fonte botânica, quantifica a complexação de substâncias fenólicas da própolis ao pó de pele e traz estudos, in vitro, da influência deste produto sobre proliferação de fibroblastos de camundongos (células NIH 3T3). Excetuando-se a perda por dessecação a 105 ºC, todos os demais parâmetros estiveram dentro dos limites estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, para a fixação de identidade e qualidade da própolis. Identifica os flavonóides canferol, canferida e isossacuranetina e os ácidos para-cumárico, ferúlico, clorogênico, cafeico, trans-cinâmico e Artepillin C, na própolis, e comprova ser a Baccharis dracunculifolia DC. (vassourinha) a sua fonte botânica. Mostra que a própolis foi tóxica aos fibroblastos nas concentrações de 125,00; 62,50 e 31,25 µg/mL e levemente proliferativa entre as concentrações 7,812 e 0,732 µg/mL, mas sem diferenças estatisticamente significativas em relação a seus controles. Indica que 68,12% das substâncias fenólicas presentes no extrato etanólico de própolis complexaram com pó de pele. Conclui, dentre outras coisas, que a própolis estudada apresenta grande variedade de substâncias fenólicas, adsorve fortemente a pele humana, não possui efeito proliferativo estatisticamente significativo sobre os fibroblastos de camundongo (células NIH 3T3) e, provavelmente, atua auxiliando o processo de cicatrização indiretamente, facilitando o estabelecimento das condições ideais para que a cicatrização ocorra. / Nowadays a great amount of information relating chemical and biological aspects of propolis is available in the literature, but only a few data on its therapeutic uses are found. The major reason of this fact is due to the enormous variability of chemical composition of propolis regarding the geographiclbotanic source of the material, because bees prepare propolis using different vegetable species as raw materiais from different e cosystems in the environment. In order to increase the therapeutic use of propolis, it is important to establish which biological activity corresponds to a specific type of propolis (regarding its origin and chemical composition). Therefore, the botanical and geographic origin of propolis knowledge should follow any biological investigations with this material. This paper offers a contribution to the chemical composition knowledge of propolis from São Paulo state (Serra do Japi - Brazil) and its botanical vegetable source, as well as the discussion of possible mechanisms involved in wound healing process related to this material. For this reason, presents commended Ministry of Agricultural analysis (loss on drying at 105 ºC, determinations of extractable and non-extractable matter and determinations of ash, wax, flavonoids and total phenolic contents), chemical composition studies by HPLC, comparative chromatographic analysis between propolis and its expected vegetal source, adsorption determination of phenolic substances in skin powder and fibroblast proliferation assay (NIH 3T3 cells). Excepting the drying loss test at 105 ºC, all the parameters have been according the limits established by the Ministry of Agricultural to guarantee the identity and quality of propolis. Identification of kaempferol, kaempferide, isosakuranetin, Artepillin C, p-coumaric acid, ferulic acid, chlorogenic acid, caffeic acid and t-cinnamic acid in propolis was possible. The specie Baccharis dracunculifolia DC was identified as the vegetable source of the propolis. About 68% of phenolic substances present in the original extract adsorbed to the skin powder. Propolis was toxic to the fibroblasts at 125,0, 62,5, and 31,25 µg/mL and slightly proliferative between concentrations of 7,812 and 0,732 µg/mL but with no significant statistic differences relating the controls. It is conclusive that the propolis under study presents a great variety of phenolic substances, adheres strongly to the human skin, presents no proliferative effect to the mouse fibroblasts (NIH 3T3 cells) and probably helps to esta blish good conditions to the wound healing process.

Orientador: Fernando Antonio Cabral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T11:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piantino_CarlaRoberta_M.pdf: 1329816 bytes, checksum: a1ff2a32e69a174c17fb18c61821b0db (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Extratos de folhas de Baccharis dracunculifolia foram obtidos usando como solventes, o dióxido de carbono supercrítico (SC-CO2), o etanol e o metano. Coletou-se também em alguns ensaios de SC-CO2, a fração + voláteis do óleo essencial pela captura em armadilha com adsorvente Porapak-Q. Os ensaios com SC-CO2 foram realizados em triplicata nas pressões de 200, 300 e 400 bar e nas temperaturas de 40, 50 e 60°C. Mediram-se o rendime nto global de extração (Xo), a atividade antioxidante por seqüestro do radical DPPH e a atividade antimicrobiana pelo método de difusão em disco. Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR) foi utilizada para determinação de quatro compostos fenólicos: ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, também conhecido como Artepillin C), ácido 3-prenil-4-hidroxicinâmico (PHCA), ácido 4-hidroxicinâmico (ácido p-cumárico); 4¿-metoxi-3,5,7-triidroxiflavona (canferide). A composição dos óleos essenciais foi obtida por análise de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM). Os rendimentos globais de extração (Xo) obtidos pelos métodos convencionais com etanol e metanol foram respectivamente 6,11 e 10,94%, sendo maiores que os valores entre 2,40 e 4,71% obtidos por SC-CO2. Observou-se que a concentração dos componentes fenólicos analisados nos extratos supercríticos obtidos a 60oC e 400 bar foi maior que nos extratos alcoólicos, exceto para o ácido p-cumárico e os rendimentos de extração de canferide, Artepillin C e PHCA foram 156%, 98% e 64%, respectivamente, maiores nos ensaios com SC-CO2 que nos extratos alcoólicos. O rendimento médio dos voláteis foi de 0,17% e esses voláteis apresentaram teores de monoterpenos entre 16,5 e 26,5%, teores de hidrocarbonetos sesquiterpênicos de 60,8 a 74,3% e teores de álcoois sesquiterpênicos de 5,1 a 10,7%. Os melhores resultados de atividade antioxidante foram encontrados no extrato etanólico (ED50 = 26,68 µg/mL) e no extrato supercrítico obtido a 50ºC e 300 bar com 5% de etanol na matriz (ED50 = 23,88 µg/mL). Todos os extratos, exceto o metanólico, apresentaram atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus / Abstract: Extracts from Baccharis dracunculifolia leaves were obtained using the following solvents: supercritical carbon dioxide (SC-CO2), ethanol and methanol. The most fraction + volatiles of essential oil of some SC-CO2 trials was obtained by trapping it on adsorbent Porapak-Q. Supercritical extraction was carried out in triplicate at temperatures of 40, 50 and 60ºC and pressures of 200, 300 and 400 bar. The global extraction yields (X0), the antioxidant activity using DPPH radical scavenging and the antimicrobial activity using the disk diffusion method were determined. Four phenolic compounds were analyzed in the extracts by reversed phase highperformance liquid chromatography (RP-HPLC): 3,5-diprenyl-4-hydroxycinnamic acid (DHCA or Artepillin C); 3-prenyl-4-hydroxycinnamic acid (PHCA); 4- hydroxycinnamic acid (p-coumaric acid) and 4¿-methoxy-3,5,7-trihydroxyflavone (kaempferide). The essential oils' composition was evaluated by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The global extraction yields (X0) obtained by the conventional methods with ethanol and methanol were 6.11 and 10.94%, respectively. These results were higher than the ones obtained by SC-CO2 (between 2.40 and 4.71%). In the supercritical extracts obtained at 60ºC and 400 bar, the concentration of analysed phenolic compounds were higher than in the alcoholic extracts (except to p-coumaric acid), and the extraction yields of kaempferide, artepillin C and PHCA, were 156%, 98% and 64% higher, respectively, than in the alcoholic extracts. The average yield of volatiles obtained from supercritical extration was 0.17%. These volatiles presented monoterpenes contents between 16.5% and 26.5%, sesquiterpene hydrocarbons contents 60.8% and 74.3%, and sesquiterpene alcohols between 5.1% and 10.7%. The ethanolic extract (ED50 = 26.68 µg/mL) and the supercritical extract obtained at 50ºC and 300 bar with 5% of ethanol in the matrix (ED50 = 23.88 µg/mL) were shown to have the higher antioxidant activities among all the studied extracts. All extracts, except the methanolic one, presented antimicrobial activity against Staphylococcus aureus / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Atualmente, há uma considerável quantidade de informações relativas a aspectos químicos e biológicos da própolis, porém sua aplicação terapêutica ainda pode ser considerada incipiente. Isto se deve, principalmente, a grande variabilidade da composição química deste produto em função de sua origem geográfica/botânica, já que em diferentes ecossistemas as abelhas recorrem a distintas espécies vegetais como fontes de matérias-primas para sua elaboração. Desta forma, para se chegar a uma futura padronização, os conhecimentos da(s) fonte(s) botânica(s) e da origem geográfica da amostra são fundamentais e devem acompanhar qualquer estudo biológico, no sentido de se estabelecer quais atividades biológicas correspondem a um tipo específico de própolis. O presente trabalho objetiva contribuir para os conhecimentos da composição de própolis do estado de São Paulo (coletado na Serra do Japi) e de sua fonte botânica, bem como para a discussão dos possíveis mecanismos envolvidos em processos de cicatrização, influenciados pela aplicação tópica de própolis (um de seus usos mais difundidos mundialmente é como \"cicatrizante\"). Para tanto, traz análises físico-químicas, preconizadas pelo Ministério da Agricultura (teores de cinzas, cera, sólidos solúveis, flavonóides e fenóis totais, perda por dessecação a 105 ºC e massa mecânica), estudos de composição química pela técnica CLAE, análises cromatográficas comparativas entre o extrato metanólico de própolis e de sua suposta fonte botânica, quantifica a complexação de substâncias fenólicas da própolis ao pó de pele e traz estudos, in vitro, da influência deste produto sobre proliferação de fibroblastos de camundongos (células NIH 3T3). Excetuando-se a perda por dessecação a 105 ºC, todos os demais parâmetros estiveram dentro dos limites estabelecidos pelo Ministério da Agricultura, para a fixação de identidade e qualidade da própolis. Identifica os flavonóides canferol, canferida e isossacuranetina e os ácidos para-cumárico, ferúlico, clorogênico, cafeico, trans-cinâmico e Artepillin C, na própolis, e comprova ser a Baccharis dracunculifolia DC. (vassourinha) a sua fonte botânica. Mostra que a própolis foi tóxica aos fibroblastos nas concentrações de 125,00; 62,50 e 31,25 µg/mL e levemente proliferativa entre as concentrações 7,812 e 0,732 µg/mL, mas sem diferenças estatisticamente significativas em relação a seus controles. Indica que 68,12% das substâncias fenólicas presentes no extrato etanólico de própolis complexaram com pó de pele. Conclui, dentre outras coisas, que a própolis estudada apresenta grande variedade de substâncias fenólicas, adsorve fortemente a pele humana, não possui efeito proliferativo estatisticamente significativo sobre os fibroblastos de camundongo (células NIH 3T3) e, provavelmente, atua auxiliando o processo de cicatrização indiretamente, facilitando o estabelecimento das condições ideais para que a cicatrização ocorra. / Nowadays a great amount of information relating chemical and biological aspects of propolis is available in the literature, but only a few data on its therapeutic uses are found. The major reason of this fact is due to the enormous variability of chemical composition of propolis regarding the geographiclbotanic source of the material, because bees prepare propolis using different vegetable species as raw materiais from different e cosystems in the environment. In order to increase the therapeutic use of propolis, it is important to establish which biological activity corresponds to a specific type of propolis (regarding its origin and chemical composition). Therefore, the botanical and geographic origin of propolis knowledge should follow any biological investigations with this material. This paper offers a contribution to the chemical composition knowledge of propolis from São Paulo state (Serra do Japi - Brazil) and its botanical vegetable source, as well as the discussion of possible mechanisms involved in wound healing process related to this material. For this reason, presents commended Ministry of Agricultural analysis (loss on drying at 105 ºC, determinations of extractable and non-extractable matter and determinations of ash, wax, flavonoids and total phenolic contents), chemical composition studies by HPLC, comparative chromatographic analysis between propolis and its expected vegetal source, adsorption determination of phenolic substances in skin powder and fibroblast proliferation assay (NIH 3T3 cells). Excepting the drying loss test at 105 ºC, all the parameters have been according the limits established by the Ministry of Agricultural to guarantee the identity and quality of propolis. Identification of kaempferol, kaempferide, isosakuranetin, Artepillin C, p-coumaric acid, ferulic acid, chlorogenic acid, caffeic acid and t-cinnamic acid in propolis was possible. The specie Baccharis dracunculifolia DC was identified as the vegetable source of the propolis. About 68% of phenolic substances present in the original extract adsorbed to the skin powder. Propolis was toxic to the fibroblasts at 125,0, 62,5, and 31,25 µg/mL and slightly proliferative between concentrations of 7,812 and 0,732 µg/mL but with no significant statistic differences relating the controls. It is conclusive that the propolis under study presents a great variety of phenolic substances, adheres strongly to the human skin, presents no proliferative effect to the mouse fibroblasts (NIH 3T3 cells) and probably helps to esta blish good conditions to the wound healing process.

Orientadores: Fernando Antonio Cabral, Pedro Melillo de Magalhães / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T23:29:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MartinezCorrea_HugoAlexander_D.pdf: 12984734 bytes, checksum: 34a2c042bc6939af2af1c5d398b6e2cc (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Esta pesquisa teve por objetivo a obtenção de extratos naturais por meio da combinação de processos de extração. Extratos foram obtidos a partir de extração em uma etapa ou em duas etapas; neste último caso a primeira etapa foi com CO2 supercrítico (400 bar, 60 °C) e a segunda etapa, etanol (25 °C) ou água (60 °C). Foram empregadas as seguintes matrizes vegetais: B. dracunculifolia, E. uniflora, C. longa L. , A. annua e B. pilosa. Todos os extratos foram caracterizados quanto ao conteúdo de compostos fenólicos totais, de flavonóides totais e concentração de algumas substâncias alvo específicas: ácido 3,5-diprenil-4-hidroxicinâmico (DHCA, artepillin C) em extratos da B. dracunculifolia, artemisinina em extratos de A. annua e curcumina em extratos de C. longa L. Foi determinada a atividade antioxidante pelos métodos do DPPH e descoloração de beta caroteno (DBC), e atividade antiplasmódica. O estudo foi complementado com a obtenção de dados experimentais de solubilidade de esqualeno em CO2 supercrítico a 40, 50 e 60 °C nas pressões de 100, 200, 300 e 400 bar. Dados de solubilidade da artemisinina em CO2 supercrítico reportados na literatura foram usados. Para este dois sistemas foi estudada a capacidade de equações de estado e modelos empíricos na descrição termodinâmica do seu comportamento.A análise de resultados mostrou que a combinação de processos resulta em uma estratégia eficiente para obtenção de extratos com diferentes composições e funcionalidade. Nesse sentido, a influência da extração supercrítica como primeira etapa é dependente da matriz vegetal estudada e do solvente empregado na segunda etapa. Nas matrizes B. dracunculifolia, B. pilosa e A annua, processos em etapa única com etanol permitem obter extratos mais concentrados em compostos da família dos flavonóides. O CO2 supercrítico e etanol permitiram obter extratos mais concentrados em artemisinina (95,1 mg/g e 95,6 mg/g). Artepilin C foi extraído com maior eficiência com CO2 supercrítico (17,26 mg/g e 26,40 mg/g para duas amostras da B. dracunculifolia). Para processo em duas etapas, a influência da extração com CO2 supercrítico sobre a etapa posterior de extração etanólica foi positiva, obtendo-se extratos 1,6 vezes mais concentrados em curcumina a partir da C. longa, e em compostos fenólicos a partir da B. dracunculifolia, C. longa, A, annua e B. pilosa. Os resultados para atividade antioxidante mostram que extratos etanólicos (E, SCE) apresentam alta atividade para extratos de B. dracunculifolia, E. uniflora e C. longa, tanto no método do DPPH, quanto no método de descolaração do ß-caroteno (DBC). Em relação à atividade antiplasmódica, a extração etanólica em duas etapas, a partir de B. pilosa, permitiu obter extratos mais ativos dentre os estudados, com concentração inibitória (IC50) igual a 126,3 µg/mL. A modelagem termodinâmica de dados de solubilidade de artemisina e esqualeno em scCO2 mostrou que a equação cúbica de Peng-Robinson apresentou melhor descrição do comportamento termodinâmico em relação à equação GC EOS (equação de estado por contribuição de grupos). O modelo GC EOS, descreve parcialmente o comportamento experimental da solubiliade do esqualeno em dióxido de carbono supercrítico, resultando fortemente dependentes dos parâmetros dos compostos puros e dos métodos usados na predição dos mesmos / Abstract: This study aimed to obtain extracts by combination of extraction processes. These extracts were obtained from single extraction step or two steps, in the latter case the first step was with supercritical CO2 (60 °C and 400 bar) and a second step, ethanol (25 °C) or water (60 °C). We used the following matrices plant B. dracunculifolia, E. uniflora, C. longa L. A. annua and B. pilosa. All extracts were analyzed for content of total phenolics, total flavonoids and concentration of specific target substances: 3.5-cinnamic acid-4-hydroxycinnamic (DHCA, artepillin C) in extracts of B. dracunculifolia, artemisinin in extracts of A. annua and curcumin in extracts of C. longa L. Functional properties were determined: antioxidant activity by DPPH and ß-carotene bleaching (DRB) assays and antiplasmodial activity. The study was complemented with the experimental determination of squalene solubility in supercritical CO2 at 40, 50 and 60 ° C at pressures of 100, 200, 300 and 400 bar. Data solubility of artemisinin in supercritical CO2 reported in the literature were used. For these two systems we studied the ability of equations of state and empirical models in the thermodynamic description of their behavior. The results showed that combination processes is an effective strategy to obtain extracts with different compositions and functionality. It was found that the influence of supercritical CO2 extraction as a first extraction step varies with plant matrix and solvent used on the second step. For B. dracunculifolia, B. pilosa and A. annua, ethanolic one-step processes, produces more concentrated extracts on flavonoids compounds. The supercritical CO2 and ethanol on single step process allows to obtain more concentrated extracts on artemisinin (95.1 mg/g and 95.6 mg/g, respectively). Artepillin C was more efficiently extracted from B. dracunculifolia with supercritical CO2 (17.26 mg/g and 26.40 mg/g for two samples of B. dracunculifolia). For two step process, positive influence of previous supercritical CO2 extraction on the later ethanolic stage, producing extracts 1.6 times more concentrated on curcumin from C. longa, and phenolic compounds from B. dracunculifolia, C. Longa, A. anua and B. pilosa. Results for antioxidant activity showed that ethanolic extracts (E, SCE) from B. dracunculifolia, E. uniflora and C. longa, had high activity on DPPH and ß-carotene bleaching (DBC) assays. For antiplasmodial activity, ethanolics extracts from B. pilosa on two steps process were the most active among those studied, with inhibitory concentration (IC50) equal to 126.3 mg / mL. Thermodynamic modeling for artemisinin and squalene solubility in supercritical CO2 showed best performance for Peng-Robinson equation in to describing thermodynamic behavior than GC EOS Equation (Group contribution Equation of State), which partially describes the behavior of squalene solubility. In all cases the results were found strongly dependent on the parameters of pure compounds and methods used to predict them / Doutorado / Doutor em Engenharia de Alimentos