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Oxygen uptake ( O2) kinetics determine the magnitude of the O2 deficit and the degree of metabolic perturbation and is considered to be an important determinant of exercise tolerance; however, there is limited empirical evidence to demonstrate that O2 kinetics is a direct determinant of exercise tolerance. The purpose of this thesis was to investigate O2 kinetics as a determinant of exercise tolerance and to consider its potential interaction with the maximum O2 ( O2max) and the W′ (the curvature constant of the hyperbolic power-duration relationship) in setting the tolerable duration of exercise. Recreationally-active adult humans volunteered to participate in the investigations presented in this thesis. Pulmonary O2 kinetics was assessed on a breath-by-breath basis and exercise tolerance was assessed by a time-to-exhaustion trial, with exhaustion taken as the inability to maintain the required cadence. A period of repeated sprint training (RST) resulted in faster phase II O2 kinetics (Pre: 29 ± 5, Post: 23 ± 5 s), a reduced O2 slow component (Pre: 0.52 ± 0.19, Post: 0.40 ± 0.17 L•min-1), an increased O2max (Pre: 3.06 ± 0.62, Post: 3.29 ± 0.77 L•min-1) and a 53% improvement in severe exercise tolerance. A reduced O2 slow component and enhanced exercise tolerance was also observed following inspiratory muscle training (Pre: 0.60 ± 0.20, Post: 0.53 ± 0.24 L•min-1; Pre: 765 ± 249, Post: 1061 ± 304 s, respectively), L-arginine (ARG) administration (Placebo: 0.76 ± 0.29 L•min-1 vs. ARG: 0.58 ± 0.23; Placebo: 562 ± 145 s vs. ARG: 707 ± 232 s, respectively) and dietary nitrate supplementation administered as nitrate-rich beetroot juice (BR) (Placebo: 0.74 ± 0.24 vs. BR: 0.57 ± 0.20 L•min-1; Placebo: 583 ± 145 s vs. BR: 675 ± 203, respectively). However, compared to a control condition without prior exercise, the completion of a prior exercise bout at 70% Δ (70% of the difference between the work rate at the gas exchange threshold [GET] and the work rate at the O2max + the work rate at the GET) with 3 minutes recovery (70-3-80) speeded overall O2 kinetics by 41% (Control: 88 ± 22 s, 70-3-80: 52 ± 13 s), but impaired exercise tolerance by 16% (Control: 437 ± 79 s, 70-3-80: 368 ± 48 s) during a subsequent exercise bout. When the recovery duration was extended to 20 minutes (70-20-80) to allow a more complete replenishment of the W′, overall kinetics was speeded to a lesser extent (by 23%; 70-20-80: 68 ± 19 s) whereas exercise performance was enhanced by 15% (70-20-80: 567 ± 125 s) compared to the control condition. In addition, the faster O2 kinetics observed when exercise was initiated with a fast start (FS; 35 ± 6 s), compared to an even start (ES; 41 ± 10 s) and slow start (SS; 55 ± 14 s) pacing strategy, allowed the achievement of O2max in a 3 minute trial and exercise performance was enhanced. Exercise performance was unaffected in a 6 minute trial with a FS, despite faster O2 kinetics, as the O2max was attained in all the variously paced trials. Therefore, the results of this thesis demonstrate that changes in exercise performance cannot be accounted for, purely, by changes in O2 kinetics. Instead, enhanced exercise performance appears to be contingent on the interaction between the factors underpinning O2 kinetics, the O2max and the W′, in support of the proposed ‘triad model’ of exercise performance.

Neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imunológico, eles produzem substâncias microbicidas, tais como espécies reativas de oxigênio (ERO), são capazes de eliminar patógenos e possuem papel importante em processos inflamatórios fisiológicos e patológicos. No entanto, os efeitos benéficos e nocivos mediados por esta célula dependem, em grande parte, do equilíbrio redox, que se estabelece entre a produção de ERO e a ação de antioxidantes. A quebra deste equilíbrio leva ao estresse oxidativo, capaz de causar danos pelas ERO sobre as estruturas biológicas. Sendo assim, a regulação das funções dos neutrófilos é um importante alvo terapêutico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação de produtos naturais - extrato bruto, frações e subfrações - oriundas da Antártica na regulação do metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos. Para este propósito, o extrato bruto da alga Palmaria decipiens, nove (9) frações do fungo endofítico Aspergillus unguis e nove (9) subfrações deste foram estudadas. As amostras foram avaliadas quanto à atividade scavenger, utilizando-se o 2,2-difenil-?-picrilhidrazil; à citotoxidade aos neutrófilos, por análise da viabilidade celular com o ensaio de exclusão do Azul de Trypan; e ao efeito sobre a produção de ERO pelos neutrófilos, medida por quimiluminescência dependente de luminol, utilizando-se forbol-12-miristato-13-acetato como estímulo para os neutrófilos. Os resultados mostraram que: 1) nenhuma das amostras apresentou atividade scavenger; 2) a viabilidade celular manteve-se igual ou maior que 90% quando neutrófilos foram expostos às frações FR5, FR6*, FR8, e às subfrações contendo 100% Acetato de Etila, 10% Acetato de Etila:Hexano, 20% Acetato de Etila:Hexano e 40% Acetato de Etila:Hexano; 3) dentre as frações que mostraram viabilidade celular maior que 90%, a inibição da produção de ERO pelos neutrófilos foi observada com a FR5 (51%), a FR6* (20%), a subfração 100% Hexano (73%), a subfração 20% Acetato de Etila/Hexano (42%) e a subfração 40% Acetato de Etila/Hexano (38%). Os resultados mostram que algumas das frações e subfrações do fungo endofítico Aspergillus unguis apresentaram inibição da produção de ERO pelos neutrófilos humanos entre (20 a 73%). Esta inibição não é por atividade scavenger de radiciais de oxigênio, sugerindo que este efeito regulador sobre o neutrófilo possa resultar da atividade dos componentes nestas frações sobre outras vias metabólicas desta célula. A partir destes resultados, faz-se necessário identificar a composição destas frações e seus efeitos sobre vias metabólicas e sobre outras funções efetoras dos neutrófilos. A contribuição deste estudo é a procura por moléculas bioativas, capazes de regular parcialmente as respostas do neutrófilo, para restabelecer o equilíbrio funcional desta célula em estados patológicos, diminuindo seus efeitos nocivos sem prejuízo do seu papel crucial para a homeostase. / Neutrophils are the first line of defense of the immune system, they produce microbicidal substances, such as reactive oxygen species (ROS), able to eliminate pathogens and play important roles in physiological and pathological inflammatory processes. However, the beneficial and harmful effects mediated by this cell depend on the redox balance, which is established between the production of ROS and the action of antioxidants. The imbalance leads to oxidative stress capable of causing damage by ROS on biological structures. Thus, the regulation of neutrophil functions is an important therapeutic target. The aim of this work was to evaluate the action of natural products - crude extract, fractions and subfractions - originating from Antarctica environment in the regulation of the oxidative metabolism of human neutrophils. For this purpose, the crude extract of the Palmaria decipiens algae, nine (9) fractions of the endophytic fungus Aspergillus unguis and nine (9) subfractions from this fungus were studied. The samples were evaluated for scavenger activity using 2,2-diphenyl-?-picrylhydrazyl; cytotoxicity to neutrophils, by cellular viability analysis with the Trypan Blue exclusion assay; and to the effect on neutrophil production of ROS, as measured by luminol-dependent chemiluminescence, using phorbol 12-myristate 13-acetate as a stimulus for neutrophils. The results showed that: 1) none of the samples had scavenger activity; 2) the cell viability remained equal to or greater than 90% when neutrophils were exposed to fractions FR5, FR6*, FR8, and subfractions containing 100% Ethyl Acetate, 10% Ethyl Acetate:Hexane, 20% Ethyl Acetate:Hexane and 40% Ethyl Acetate:Hexane; 3) among the fractions that showed cellular viability greater than 90%, the inhibition of ROS production by neutrophils was observed with FR5 (51%), FR6* (20%), subfraction 100% Hexane (73%), the subfraction 20% Ethyl acetate / Hexane (42%) and subfraction 40% Ethyl acetate / Hexane (38%). The results show that some of the fractions and subfractions of the endophytic fungus Aspergillus unguis showed inhibition of ROS production by human neutrophils between (20 to 73%). This inhibition is not by scavenger activity of oxygen radicals, suggesting that this regulatory effect on the neutrophil may result from the activity of the components in these fractions on other metabolic pathways of this cell. From these results, it is necessary to identify the composition of these fractions and their effects on metabolic pathways and on other effector functions of neutrophils. The contribution of this study is the search for bioactive molecules, able to partially regulate neutrophil responses, to restore the functional balance of this cell in pathological states, reducing its harmful effects without prejudice to its crucial role for homeostasis.

Orientador: Augusto Ducati Luchessi / Resumo: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é uma proteína altamente conservada em archaeas e eucariotos. Caracteriza-se por ser a única proteína conhecida a apresentar o resíduo de aminoácido hipusina, produzido a partir de uma modificação pós-traducional denominada hipusinação, a qual é essencial para sua atividade. Atualmente eIF5A é correlacionada com o início, elongação e término da tradução, além disso, sua função têm sido associada com diferentes processos celulares, fisiológicos e patológicos. Em humanos, é predito que eIF5A seja gerada a partir de cinco variantes transcricionais (A, B, C, D e X5). As variantes B, C, D e X5 codificam a proteína canônica isoforma B de 17 kDa, a qual vêm sendo estudada nas últimas décadas. Entretanto, é previsto que a variante A codifique uma isoforma alternativa (isoforma A) de 20 kDa, que tem uma sequência adicional de 30 aminoácidos na extremidade N-terminal. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar eventos moleculares inéditos envolvendo a isoforma A de eIF5A1 humana. Neste estudo, mostramos que a isoforma A é produzida em células HeLa, a qual foi mostrada ser passível de hipusinação. Análises de bioinformática mostraram que a isoforma A possui alta probabilidade de direcionamento para mitocôndria. Assim, técnicas de fracionamento subcelular mostraram que a isoforma A co-purifica com a mitocôndria, diferentemente da isoforma B. Análises de silenciamento gênico em células HeLa, utilizando moléculas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is a highly conserved protein in archaeas and eukaryotes. It is characterized by being the only protein known to present the amino acid residue hypusine, produced from a post-translational modification called hypusination, which is essential for its activity. Currently eIF5A is correlated with the beginning, elongation and termination of translation, and its function has been associated with different cellular, physiological and pathological processes. In humans, eIF5A is predicted to be generated from five transcriptional variants (A, B, C, D and X5). Variants B, C, D and X5 encode the 17 kDa canonical protein B, which has been studied in recent decades. However, variant A is expected to encode an alternative 20 kDa isoform (A isoform), which has an additional 30 amino acid sequence in the N-terminal region. In this context, the present study aimed to characterize unpublished molecular events involving the human eIF5A1 isoform A. In this study, we showed that in HeLa cells, isoform A was detected, which was shown to be subject to hypusination. Bioinformatics analysis showed that isoform A has a high probability of targeting mitochondria. Thus, subcellular fractionation techniques have shown that isoform A co-purifies with mitochondria, unlike isoform B. Analysis of gene silencing in HeLa cells using eIF5A1 isoform A-specific siRNA molecules showed that protein depletion is capable of cause apoptosis in cells, as well as... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

My study investigated the evolution of oxidative metabolism in fishes. While intense selection for, or against, non-synonymous point mutations in coding sequence drives the evolution of mitochondrial OXPHOS genes, genome-specific mechanisms such as gene duplication events can play major roles in the evolution of nuclear OXPHOS genes. My thesis focused on the mitochondrial enzyme cytochrome c oxidase (COX), principally in fish because of their evolutionary origins and functional diversity in terms of energy metabolism. In the first part of my thesis, I examined a highly aerobic group of fishes (billfishes and tunas) to study the evolution of mitochondrial COX genes. Though the study began as a structure-function analysis of COX, my approach changed when my preliminary results called into question the accepted phylogenetic relationships of my species of interest. We generated a robust multigene phylogeny of this group to interpret data in a phylogenetically informative context. Phylogenetic analyses in this group provided us with a framework to study the evolution of mitochondrial OXPHOS genes, but unexpectedly revealed that: 1) billfishes are only distantly related to tunas, and share greater evolutionary affinities with flatfishes (Pleuronectiformes) and jacks (Carangidae), and 2) regional endothermy has evolved in a non-scombroid suborder in teleosts. These results collectively imply that regional endothermy has evolved independently at least twice within teleost fish. The second part of my thesis explored the evolution of the nuclear COX subunits, focusing on their origins in fish. Isoform transcription profiles coupled with phylogenetic analyses for each subunit show that vertebrate isoforms arose from a combination of early whole-genome duplications in basal vertebrates or specific lineages (e.g. teleosts), and more recent single gene duplication events. While there is evidence for retained function of some COX orthologues across fishes and mammals, others appear to have diverged in function since their earlier radiation, possibly contributing novel evolutionary functions. Together these two studies provide insight into the evolutionary forces facilitating adaptive change in mitochondrial and nuclear OXPHOS genes. / Thesis (Master, Biology) -- Queen's University, 2009-09-11 11:00:12.562

no / Tissue stem cells and germ line or embryonic stem cells were shown to have reduced oxidative metabolism, which was proposed to be an adaptive mechanism to reduce damage accumulation caused by reactive oxygen species. However, an alternate explanation is that stem cells are less dependent on specialized cytoplasmic functions compared with differentiated cells, therefore, having a high nuclear-to-cytoplasmic volume ratio and consequently a low mitochondrial content. To determine whether stem cells rely or not on mitochondrial respiration, we selectively ablated the electron transport chain in the basal layer of the epidermis, which includes the epidermal progenitor/stem cells (EPSCs). This was achieved using a loxP-flanked mitochondrial transcription factor A (Tfam) allele in conjunction with a keratin 14 Cre transgene. The epidermis of these animals (TfamEKO) showed a profound depletion of mitochondrial DNA and complete absence of respiratory chain complexes. However, despite a short lifespan due to malnutrition, epidermal development and skin barrier function were not impaired. Differentiation of epidermal layers was normal and no proliferation defect or major increase of apoptosis could be observed. In contrast, mice with an epidermal ablation of prohibitin-2, a scaffold protein in the inner mitochondrial membrane, displayed a dramatic phenotype observable already in utero, with severely impaired skin architecture and barrier function, ultimately causing death from dehydration shortly after birth. In conclusion, we here provide unequivocal evidence that EPSCs, and probably tissue stem cells in general, are independent of the mitochondrial respiratory chain, but still require a functional dynamic mitochondrial compartment.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade funcional dos polimorfonucleares (PMNs) do sangue de cabritos neonatos "in vitro" - metabolismo oxidativo e a fagocitose induzidos por S.aureus e E.coli, por meio da citometria de fluxo. Foram utilizados 32 cabritos da raça Saanen, acompanhados quanto ao estado de saúde do nascimento até os 15 dias de idade, distribuídos em quatro grupos: G1- colostro de cabra "in natura"; G2- colostro de cabra aquecido a 56ºC por 60 minutos; G3- colostro de vaca "in natura" e G4 - leite de cabra; sendo avaliados nos seguintes tempos: t0 (antes da ingestão do colostro); t1 (24-48h p.n.); t2 (72-96h p.n); t3 (168-192h p.n) e t4 (336-360h p.n). A avaliação estatística foi realizada pela análise de variância (ANOVA) para a comparação entre os grupos e intragrupos para amostras de pequeno tamanho, de acordo com as variáveis do estudo, com nível de significância de 5%. O metabolismo oxidativo basal não diferiu nos grupos e com a idade. O metabolismo oxidativo aumentou com o estímulo por S. aureus após a ingestão de colostro tratado pelo calor (G2), não apresentando diferenças nos demais grupos. O estímulo com E. coli o aumentou após a ingestão de colostro tratado (G2) e após a ingestão de leite de cabra (G4) a partir de t3, não diferindo nos grupos que receberam colostro de cabra e vaca "in natura" (G1 e G3 respectivamente). A comparação entre metabolismo oxidativo basal e induzido para o S. aureus foi maior antes e após a mamada do colostro nos grupos colostro de cabra "in natura" e sem colostro (G1 e G4); e, após a ingestão do colostro nos grupos que o receberam tratado pelo calor e de vaca respectivamente (G2 e G3). Para a E. coli a resposta foi maior após a ingestão de colostro tratado pelo calor (G2); antes e após a mamada de colostro de vaca (G3) ou leite (G4); não houve diferença entre o metabolismo basal e induzido para a E. coli no grupo que recebeu colostro de cabra "in natura" (G1). A fagocitose induzida pelo S.aureus não diferiu em nenhum dos grupos; o percentual de fagocitose aumentou após a ingestão de colostro de cabra "in natura" (G1) no momento t1. A fagocitose induzida pela E.coli foi maior após a ingestão de colostro de cabra nos dois grupos. O percentual de fagocitose foi maior após a ingestão do colostro tratado pelo calor e não diferiu nos demais grupos. Os resultados permitiram concluir que a ingestão do colostro não interferiu no metabolismo oxidativo basal; o desencadeamento da explosão respiratória de PMNs induzido pelas bactérias foi maior após a ingestão de colostro de cabra aquecido a 56ºC por 60 minutos; houve indícios de aumento da fagocitose para S. aureus e um aumento da intensidade de fluorescência e do percentual de fagocitose para E.coli nos grupos que receberam colostro de cabra (G1 e G2); não ficou esclarecida a influência da idade na atividade funcional de PMNs do sangue de cabritos neonatos "in vitro"; os resultados do presente estudo subsidiam propostas de melhoria do manejo da produção caprina baseada na utilização de colostro de cabra tratado pelo calor. / The aim of this study was to evaluate "in vitro" functional activities of neonates goats blood polymorphonuclear leukocytes (PMNs) respiratory burst and phagocytosis induced by S. aureus and E. coli, by flow cytometry. We used 32 Saanen goats, accompanied on the health status from birth to 15 days of age divided into four groups: G1-goat colostrum \"in nature\"; G2- goat colostrum heated to 56 ° C for 60 minutes; G3-cow colostrum \"in nature\" and G4 - goat milk, being evaluated at the following times: t0 (before intake of colostrum), t1 (24-48h after birth), t2 (72-96h a.b), t3 (168-192h a.b), t4 (336-360h a.b). Statistical analysis was performed by analysis of variance (ANOVA) for comparison between groups and within groups for samples of small size, according to the study variables, with 5% of significance. The respiratory burst did not differ in basal and age groups. The stimulation of respiratory burst in S. aureus increased significantly after ingestion of colostrum treated by heat (G2) and it was not different in the other groups. Stimulation with E. coli increased after colostrum treated by heat intake (G2) and after ingestion of goat\'s milk (G4) from t3; no difference in the groups that received colostrum from goats and cows \"in nature\" (G1 and G3 respectively). The comparison of basal and induced respiratory burst for S. aureus was higher before and after the intake of colostrum or goat milk in the groups colostrum \"in nature\" and without colostrum (G1 and G4) and, after ingestion of colostrum in the groups treated with heat and bovine colostrum, respectively (G2 and G3). For E. coli, response was higher after ingestion of colostrum treated by heat (G2), before and after feeding cow colostrum (G3) or goat milk (G4), there was no difference between basal metabolism and induced to E. coli in the group that received goat colostrum \"in nature\" (G1). Phagocytosis induced by S. aureus did not differ in any group, the percentage of phagocytosis increased after ingestion of goat colostrum \"in nature\" (G1) at time t1. Phagocytosis induced by E. coli was increased after colostrum intake in both groups that received goat colostrum. The percentage of phagocytosis was increased after ingestion of colostrum but it did not differ in treated and other groups. The results showed that ingestion of colostrum did not affect the basal respiratory burst; triggering the respiratory burst of PMNs induced by bacteria was greater after eating goat colostrum heated to 56 ° C for 60 minutes, there was evidence of increased phagocytosis of S. aureus and there was an increase in fluorescence intensity and percentage of phagocytosis of E.coli in the groups receiving goat colostrum (G1 and G2); it was not clarified the influence of age on functional activity of PMNs from the blood of goats neonates "in vitro"; and the results of this study subsidize proposals for improving the management of goat production based on the use of goats colostrum treated by heat.

A idade entre o terceiro e o sexto mês de vida é um período peculiar para o estabelecimento da imunidade própria dos bezerros. Nesse intervalo, há susceptibilidade e índice de letalidade à broncopneumonias maiores, provavelmente devido à imaturidade do sistema imunológico pulmonar, quer seja por uma insuficiente resposta, nos primeiros momentos, quer seja por uma resposta citotóxica exagerada, no momento subsequente. A par disso, este trabalho teve o intuito de verificar o momento em que ocorre a maturidade do sistema imunológico, como se comportam os perfis Th1 e Th2 e a existência de uma resposta citotóxica exagerada, durante esta fase de estabelecimento da imunidade ativa dos bezerros. Para tal, estudaram-se as funções de fagocitose e metabolismo oxidativo de leucócitos sanguíneos e broncoalveolares, as classes de imunoglobulinas e citocinas incriminadas nos padrões de resposta linfocitária Th1 e Th2, em 10 bezerros da raça holandesa, sadios, avaliados em sete momentos experimentais, com intervalo quinzenal, entre o terceiro e o sexto mês de vida. Os dados foram submetidos à análise estatística, pela comparação entre as médias ou medianas, confrontadas pelo teste de Anova e Tukey, quando paramétricas, e pelo teste de Kruskal Wallis e Dunn, quando não paramétricas, considerando nível de significância P≤ 0,05 e tendência P≤ 0,10. Os dados que apresentaram dinâmicas semelhantes entre si foram submetidos ao teste de correlação de Pearson. Na região broncoalveolar, observaram-se um aumento progressivo das funções dos macrófagos alveolares, equilíbrio de secreção dos isotipos IgG1 e IgG2 e predominância de citocinas compatíveis com padrão de resposta Th1, até os 150 dias de vida dos bezerros. Aos 165 dias de vida, ocorreram diminuição da função celular, aumento dos títulos de IgG2 e aumento da citocina regulatória IL-10. Aos 180 dias, retornou-se o equilíbrio entre secreção de IgG1 e IgG2, diminuiram os teores de IL-10 e ocorreu tendência a aumento de IL-12, TNF-α e metabolismo oxidativo de macrófagos alveolares, o que permitiu concluir que a resposta imune tem característica própria, nesta faixa etária, e não se torna matura até os seis meses de vida. Apesar de os fagócitos pulmonares já estarem eficientes, a partir dos 135 dias de vida, tornam-se hiperresponsivos aos 150 dias de vida, momento em que gera consequentemente uma resposta regulatória e/ou humoral aos 165 dias de vida, para que aos 180 dias de vida, o equilíbrio entre os perfis Th1 e Th2 seja atingido / The age between the third and sixth month of life is a peculiar period for the establishment of active immunity of calves. There is a greater susceptibility and lethality by bronchopneumonia, probably due to the immaturity of the pulmonary immune system, whether by an insufficient response , in the first moments , whether by an exaggerated cytotoxic response in the subsequent time. So, this work aimed to verify when the maturity of the immune system occurs, how the Th1 and Th2 profiles behave and if there is an exaggerated cytotoxic response during this active phase for immunity of the calves without maternal interference. For this purpose we studied the functions of phagocytosis and oxidative metabolism of blood and bronchoalveolar leukocytes, classes of immunoglobulins and cytokines incriminated in lymphocyte response patterns Th1 and Th2, in 10 holstein healthy calves. They were sampled every fifteen days, during the third until sixth month of life. Data were statistically analyzed by comparing the means or medians, confronted by ANOVA test and Tukey, when the data were parametric, and by Kruskal Wallis and Dunn's test, when the data were nonparametric, level of significance p ≤ 0.05 and trend p ≤ 0.10. The data that showed similar dynamics between them were subjected to Pearson correlation test. In bronchoalveolar region, until 150 days of age, the alveolar macrophages functions increased progressively, the IgG1 and IgG2 isotypes secretion showed a balance, and the cytokines profile were compatible with Th1 response. At 165 days of age, there was a decrease of cellular function, an increased of IgG2 titers and the IL-10 secretion, a regulatory cytokine, increased. At 180 days of life, we observed a balance of IgG1 and IgG2 secretion, a decreased of IL-10 levels and a tendency to increase IL-12, TNF-α and alveolar macrophage oxidative metabolism. These results indicated that the calves have an active immune response with particularities for this age group and it does not become mature until six months of life. Despite of the macrophages alveolar are already efficiency from the 135 days of age, they become more reactive at 150 days. After this moment, a regulatory and/or humoral response begins at 165 days of life, as the balance of Th1 and Th2 profiles are reached at 180 days of calves life

O sistema imune inato é organizado por processos complexos que envolvem os diversos tipos celulares que culminam na eliminação de uma variedade de microorganismos a fim de proteger o organismo de infecções. Os neutrófilos são células importantes neste sistema, sendo capazes de migrar rapidamente ao foco da infecção. Estas células reconhecem e fagocitam partículas estranhas e atuam no sentido de elimina-los através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proteínas antimicrobianas e enzimas proteolíticas dos grânulos, que são liberadas no fagossomo e no espaço extracelular. Entretanto, em algumas doenças inflamatórias e autoimunes têm sido encontradas lesões nos tecidos envolvendo a produção excessiva de EROs pelos neutrófilos, desencadeada por imunocomplexos (ICs) via receptores Fc gama (Fc) e de complemento (CR). Assim, a modulação da ativação destes receptores e da produção de EROs é importante na manutenção da homeostasia. Nas últimas décadas, flavonóides são considerados como metabólitos secundários promissores mostrando atividade antioxidante e imunomodulatória. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório dos flavonóides galangina, kaempferol, quercetina e miricetina em algumas funções efetoras de neutrófilos humanos, como o metabolismo oxidativo estimulado via receptores de membrana Fc e/ou CR, fagocitose e atividade microbicida, além do efeito citotóxico, antioxidante e inibitório dessas substâncias sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e NADPH oxidase. Os flavonóides analisados mostraram um efeito modulatório negativo no metabolismo oxidativo dos neutrófilos humanos na seguinte ordem: galangina> kaempferol> quercetina > miricetina. Embora a galangina tenha exercido maior atividade, sua ação antioxidante e inibitória na atividade das enzimas MPO e NADPH oxidase foi a menos efetiva dentre os flavonóides avaliados. Além disso, esta substância inibiu de maneira mais acentuada a resposta celular mediada por ambos os receptores Fc e CR quando comparado a estimulação destes receptores individualmente. As substâncias contendo o grupo catecol, quercetina e miricetina mostraram elevada eficiência na inibição da atividade das enzimas NADPH oxidase e MPO, e na redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). De maneira geral, os flavonóides não interferiram no processo fagocítico e no mecanismo microbicida, e não induziram toxicidade e morte celular por apoptose ou necrose. Os resultados apresentados neste trabalho mostram uma possível aplicação destes flavonóides como fármacos de origem natural em doenças inflamatórias que apresentem acúmulo de neutrófilos, sendo uma ferramenta promissora para o tratamento efetivo destas doenças. / The innate immune system is composed of complex biological processes involving a variety of cell types that eliminate invading microorganisms to protect the host against infection. Neutrophils are key effector cells of this system, being able to migrate rapidly to infection sites. These cells recognize and engulf foreign particles by phagocytosis, and act to destroy them through production and release of reactive oxygen species (ROS), antimicrobial proteins and proteolytic granule enzymes, which are delivered to the phagossomes and to the extracellular environment. However, tissue damage related to excessive neutrophil ROS production triggered by immune complexes (ICs) via Fc-gamma (FcR) and complement receptors (CR) has been found in some inflammatory and autoimmune diseases. So, modulation of both the activation of these receptors and ROS generation are important to the maintenance of body homeostasis. In the last decades, flavonoids have been considered promising plant secondary metabolites with antioxidant and immunomodulatory activity. This study evaluated the modulator effect of four flavonoids (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin) in some human neutrophil effector functions, such as the oxidative metabolism stimulated via FcR and CR classes of membrane receptors, phagocytosis and microbicidal activity, as well as the cytotoxic, antioxidant and inhibitory effect of these compounds in the MPO and NADPH oxidase activity. The flavonoids studied showed a negative modulator effect in the human neutrophils oxidative metabolism in the following ranking order: galangin > kaempferol > quercetin > myricetin. Although galangin had shown the highest activity, it was the least effective antioxidant and inhibitor of MPO and NADPH oxidase activity among the flavonoids tested herein. Furthermore, this compound inhibited more the cellular response mediated by both Fc and CR receptors than by each one of them individually. The flavonoids bearing the catechol group, quercetin and myricetin, had a high efficiency to inhibit NADPH oxidase and MPO activity, as well as to reduce the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH) free radical. In general, the flavonoids did not interfere in the phagocytic process and microbicidal mechanism, and also did not induce toxicity and cell death by apoptosis or necrosis. The group of results presented here provides a possible application of these flavonoids as drugs of natural source in inflammatory diseases with excessive neutrophil infiltration, being a promising tool for an effective treatment of these illnesses.

O aumento da capacidade oxidativa é considerado o fator central dos seus benefícios à saúde induzidos pelo exercício físico aeróbio (EFA). A musculatura esquelética é um dos tecidos mais envolvidos na realização de exercícios físicos, com capacidade notável de adaptação metabólica e estrutural frente ao estímulo mecânico. Os músculos esqueléticos são ricos em mitocôndrias e altamente dependentes da fosforilação oxidativa para a produção energia. Assim, o aumento da capacidade aeróbia induzido pelo EFA ocorre grande parte em função de adaptações mitocondriais. Inúmeros estudos demonstram a capacidade do EFA em induzir biogênese mitocondrial, onde o coativador de transcrição PGC-1?1 atua coordenando a expressão de genes nucleares e mitocondriais no contexto do EFA. No entanto, animais com deleção de PGC- 1?1 no músculo esquelético ainda apresentam remodelamento mitocondrial importante após período de treinamento físico aeróbio, evidenciando a existência de mecanismos ainda desconhecidos. Embora a formação de novas mitocôndrias seja fundamental, a manutenção de mitocôndrias saudáveis por meio de mecanismos de controle de qualidade parece ser de igual ou maior importância para uma adaptação mitocondrial adequada. Um desses mecanismos de controle de qualidade mitocondrial envolve a remoção de mitocôndrias danificadas/envelhecidas via autofagia mitocondrial (mitofagia). Contudo, os mecanismos envolvidos na mitofagia induzida pelo EFA são pouco conhecidos. Considerando o papel da adaptação mitocondrial sobre os efeitos benéficos do EFA, realizamos um estudo exploratório para buscar novos mecanismos envolvidos neste processo. Para isso, utilizamos uma abordagem proteômica direcionada à fração mitocondrial muscular de camundongos submetidos a uma única sessão de EFA. Num primeiro estudo, utilizamos os resultados de proteômica para procurar por proteínas envolvidas na ativação da mitofagia durante o EFA. A partir desse estudo, verificamos que uma sessão de EFA de fato induz sinais de mitofagia na musculatura esquelética. Além disso, propomos que as proteínas Phb2 e Mief2 podem acumular em mitocôndrias danificadas durante o EFA e colaborar para o recrutamento da maquinaria autofágica para a organela, auxiliando no controle de qualidade e adaptação mitocondrial induzidos pelo EFA. Em segundo estudo, tivemos como objetivo identificar nos resultados de proteômica possíveis reguladores de transcrição gênica envolvidos na adaptação mitocondrial induzida pelo EFA. Dessa maneira, identificamos que a proteína mitocondrial Spryd4, cuja função não havia sido estudada até então, parece aumentar na fração mitocondrial muscular durante o EFA. Observamos ainda que a expressão gênica muscular de Spryd4 diminui em camundongos idosos ou com distrofia muscular, aumenta em animais saudáveis após treinamento físico aeróbio e também parece aumentar em humanos treinados. In vitro, observamos que a atenuação da expressão de Spryd4 em miotubos primários promove disfunção mitocondrial, associada à diminuição da expressão de genes de complexos mitocondriais e envolvidos no transporte e metabolismo de lipídeos, além de promover atrofia de miotubos. Num contexto geral, a análise do proteoma mitocondrial muscular após uma sessão de EFA nos permitiu identificar proteínas que parecem estar envolvidas em adaptações mitocondriais, em especial, em mecanismos de mitofagia e controle do fluxo de substratos energéticos / Increased oxidative capacity induced by regular aerobic exercise (AE) is considered a major factor in health. Skeletal muscle is one of the most compromised tissues during exercise and has remarkable metabolic and structural plasticity upon mechanical stimuli. Muscles are rich in mitochondria and heavily reliant on oxidative phosphorylation for energy production. Thus, increased aerobic capacity induced by regular AE occurs largely due to mitochondrial adaptations. Many studies have shown that AE is able to induce mitochondrial biogenesis, and the transcription coactivator PGC-1?1 is known to coordinated gene expression both in nuclei and mitochondria. However, muscle-specific PGC-1?1 knockout mice still display major mitochondrial remodeling after AE training, supporting the existence of unknown mechanisms of AE-induced mitochondrial adaptations. Although making new mitochondria is crucial, the maintenance of a healthy pool of this organelle through mechanisms of quality control seems to be of equal or greater importance during mitochondrial adaptation. One mechanism for mitochondrial quality control comprises the removal of damaged/aged mitochondria via autophagy (mitophagy). Nonetheless, the mechanisms of AE-induced mitophagy are poorly understood. Given the importance of mitochondrial adaptation to the health benefits of AE, we conducted an exploratory study to uncover new mechanisms underlying this process. For this, we performed a proteomic analysis in the skeletal muscle mitochondria-enriched fractions of mice submitted to a single bout of AE. In a first study, we have used these proteomics data to seek for proteins that might be involved in AE-induced mitophagy. On this matter, we confirmed that a single bout of AE in mice increases skeletal muscle mitophagy signaling. Additionally, we suggest that Phb2 and Mief2 accumulate in damaged mitochondria in skeletal muscle during AE and might assist in the recruitment of the autophagic machinery to the organelle, thus aiding to mitochondrial quality control and AE-induced mitochondrial adaptation. In a second study, we have used the same proteomics data to identify transcriptional regulators that might have a role in AE-induced mitochondrial adaptation. Thereby, we have found that the mitochondrial protein Spryd4, whose function was so far unknown, seems to increase in the skeletal muscle mitochondria-enriched fractions following AE. Here we show that skeletal muscle Spryd4 gene expression decreases in aged and dystrophic mice, increases in healthy trained animals and also seems to increase in trained humans. In vitro, we have seen that Spryd4 loss of function in primary myotubes promotes mitochondrial dysfunction, decreases expression of genes involved in mitochondrial complex function, as in fatty acid oxidation and transport. Indeed, Spryd4 loss of function promoted myotube atrophy. Taken together, by analyzing the skeletal muscle mitochondrial proteome after a single bout of AE in mice, we have identified proteins that might participate in AE-induced mitophagy and substrate metabolism, and thus in skeletal muscle adaptation to AE