A meta-clorofenilpiperazina (1-(3-clorofenil)piperazina; mCPP) é uma piperazina sintética que vem sendo apreendida de forma crescente no mercado de drogas ilícitas, primeiro na Europa e, a partir de 2006, também no Brasil. Recentemente há relatos de aumento significativo da apreensão de comprimidos vendidos como ecstasy e que na realidade contêm mCPP, porém estudos sobre potenciais riscos dessa utilização à saúde ainda são escassos. O papel da mCPP como agonista de receptores serotoninérgicos já está bem descrito na literatura, razão pela qual esta substância é amplamente empregada em trabalhos científicos, principalmente psiquiátricos. No entanto, poucos são os trabalhos realizados com o intuito de investigar mais profundamente as ações desencadeadas no organismo pela substância em si. É sabido que a serotonina é um neurotransmissor liberado por plaquetas no local de inflamação e que exerce papel imunomodulatório importante sobre as células imune Assim, considerando (1) a relevância atual da mCPP no contexto de apreensão de drogas de abuso, (2) a necessidade de estudos sobre efeitos das drogas de abuso no organismo, (3) escassez de avaliações dos efeitos da mCPP sobre o sistema imunológico e (4) sua provável correlação com este sistema a partir de suas ações em receptores serotoninérgicos, o presente trabalho pretendeu iniciar investigações acerca da atividade da mCPP sobre as respostas imune inatas e sobre os mecanismos da mobilização leucocitária. Para tanto, ratos Wistar machos foram tratados com mCPP (1mg/kg, v.o.) e foram realizadas quantificações de leucócitos na medula óssea, no compartimento circulante e no foco inflamatório (peritônio), em presença ou ausência de estímulo inflamatório (LPS, 1 mg/mL, i.p.), como também da mieloperoxidase presente em tecido hepático, pulmonar e do baço. Complementando os estudos in vivo, ainda foi quantificada a cortisona plasmática em animais que receberam tal tratamento tendo seus receptores de glicocorticoides previamente antagonizados (RU38486). Neutrófilos coletados do exsudato peritoneal foram incubados nas concentrações de 10 µM, 100 µM e 1000 µM in vitro e investigados a migração neutrofílica, a expressão das moléculas de adesão na superfície neutrofílica, a quantificação de mediadores inflamatórios no sobrenadante de cultura de neutrófilos e o processo de adesão neutrófilo-endotélio, com células endoteliais coletados a partir do cremáster. Os resultados demonstram que a mCPP diminuiu a quantificação de leucócitos no exsudato peritoneal e, concomitantemente, aumentou o influxo de PMN para o tecido pulmonar, em vigência de estímulo inflamatório. Ainda, in vivo, não foi possível observar diferenças na concentração de cortisona sérica entre animais cujos receptores de glicocorticóides foram antagonizados e aqueles cujos receptores em questão encontravam-se normais. In vitro, a mCPP, nas três concentrações empregadas, e tanto na vigência quanto na ausência de estímulo (LPS ou fMLP), causou alterações na migração dos neutrófilos, na adesão deste tipo celular ao endotélio, na expressão de moléculas de adesão (Lselectina, β2-integrina e PECAM-1) na superfície neutrofílica e na quantificação das concentrações de mediadores inflamatórios (NO, IL-1β, IL-10, TNF-α) no sobrenadante de cultura de neutrófilos. Os resultados obtidos sugerem, em conjunto, que a mCPP exerce atividade pró-inflamatória no que se refere à atividade neutrofílica, bem como sugerem que o fármaco seja capaz de amplificar a resposta inflamatória em modelo animal de rato, tanto in vivo quanto in vitro. / The meta-chlorophenylpiperazine is a synthetic piperazine which has been seized increasingly in the illicit drug market, primarily in Europe and after 2006, in Brazil. Recently, there has been a significant increase on the apprehension of tablets sold as ecstasy but that in reality contain mCPP. Despite its importance, studies over its potential health risks are few. The mCPP role as serotonergic receptor agonist is well known in the literature, reason why this substance is widely employed in scientific research, particularly in psychiatric studies. But there are few reports that aim to investigate thoroughly the actions that this substance triggers in the organisms. It is also known that serotonin is a neurotransmitter released by platelets at the site of inflammation and plays important immunomodulatory role on immune cells. Therefore, considering (1) the relevance of mCPP in the drug abuse context nowadays, (2) the necessity of researching the effects of the drug abuse in the organisms, (3) the lack of studies containing analysis of the mCPP effects over the immune system and (4) the probable correlation between mCPP and this system, through its activity in serotoninergic receptors, this report intended to lead investigations about the mCPP activity over the innate immune response and over the leukocyte mobilization mechanisms. For this purpose, Wistar male rats were treated with mCPP (1mg/kg, v.o.), their leukocytes were measured in the bone marrow, in the circulating compartment and in the inflammatory foci (peritoneum) in the presence or absence of inflammatory stimuli (LPS, 1 mg/mL, i.p.) and the myeloperoxidase present in liver tissue, lung and spleen was also quantified. In addition to in vivo studies, the cortisone plasma was quantified in animals receiving such treatment with glucocorticoid receptors antagonized previously (RU38486). Neutrophils collected from the peritoneal exudate were incubated at concentrations of 10 mM, 100 mM and 1000 mM in vitro. It was then investigated the neutrophil migration and the expression of adhesion molecules on the surface of neutrophils as well as the quantification of inflammatory mediators in the culture supernatant. The process of neutrophil-neutrophil adhesion to endothelium was also analyzed and endothelial cells were collected from the cremaster. Results reflect that mCPP decreased the amount of leukocytes at the peritoneal exudate and, concomitantly, increased the influx of PMN into the lung tissue during an inflammatory stimulus. Also, in vivo, it was possible to observe differences in the concentration of serum from animals which cortisone glucocorticoid receptors were previously antagonized and those in which the receptors in question were normal. In vitro, mCPP in three concentrations employed, and both in the presence or absence of stimulus (LPS or fMLP) caused changes in the migration of neutrophils, in the cell adhesion to the endothelium, in the expression of adhesion molecules (L-selectin, integrin-β2 and PECAM-1), on the surface of neutrophils and in the concentrations of inflammatory mediators (NO, IL-1β, IL-10, TNF-α) in the culture supernatant of neutrophils. The results suggest that, together, mCPP exerts pro-inflammatory activity with respect to neutrophil activity. They also suggest that the drug is able to amplify the inflammatory response in an animal model rat both in vivo and in vitro.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-12T17:50:40Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_AlexandreRosa.pdf: 9082399 bytes, checksum: 9fe59d69d2f47fa7ddf981b510013376 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-12-08T18:26:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_AlexandreRosa.pdf: 9082399 bytes, checksum: 9fe59d69d2f47fa7ddf981b510013376 (MD5) / Made available in DSpace on 2008-12-08T18:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_2007_AlexandreRosa.pdf: 9082399 bytes, checksum: 9fe59d69d2f47fa7ddf981b510013376 (MD5) / Biomedical research commonly starts by raising a hypothesis to solve a problem. In this context, scientists select the most appropriate method(s) to answer the question and solve a common dilemma. Over the past decade, we have witnessed a revolution of new technologies in molecular biology – the Omics Science. Highscale technologies such as metabolomics, cytomics, genomics and proteomics are changing the way we study complex biological systems. Current approaches to understanding the functional diversity of an organism preferentially strive for a systems biology approach whereby first the phenotypic classification of a specific cytome is achieved prior to an attempt to perform proteomic analysis. In this context, to better understand the features that involve neutrophil activation and programmed cell death in the pathological and healthy states, this study proposes the integration of cell biology approaches such as flow cytometry with a very robust proteomics platform in an attempt to integrate data at the molecular level with phenotypic data of neutrophils. The application of subcellular fractionation method using digitonin detergent extraction to enrich cytosolic proteins from neutrophils was found reproducible, simple to perform, and inexpensive. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pesquisas biomédica comumente começa com a elaboração de uma hipotese para resolver um problema. Nesse contexto, cientistas selecionam o(s) metodo(s) mais apropriado(s) para responder a questão e solucionar um dilema. Nos últimas anos, nós temos testemunhado uma revolução de novas tecnologias em biologia molecular – a ciência -Omica. Tecnologias de alta-escala tais como metabolômica, citômica, genômica e proteômica estão mudando o modo que estudamos sistemas biológicos complexos. Métodos contemporâneos para o entendimento da diversidade funcional em um dado organismo preferencialmente abordam uma visão de biologia de sistemas onde primeiro a classificação fenótipa de um citoma é alcançado antes de uma tentativa de caracterizar o proteoma de tal célula. Dentro desse contexto, e para proporcionar um melhor entendimento dos componentes envolvidos na ativação e morte celular programada dos neutrófilos nos estados patológicos e sano, esse estudo propõe a integração de métodos em biologia celular tal como citometria de fluxo com uma robusta plataforma proteômica em uma tentativa de integrar dados a nível molecular com dados fenótipicos de neutrófilos. Fracionamento subcelular usando um método de extração e enriquecimento de proteínas citosólicas com o detergente digitonina foi otimizado nesse trabalho, e encontrado ser altamente reprodutível, fácil de realizar, e de baixo custo.

A meta-clorofenilpiperazina (1-(3-clorofenil)piperazina; mCPP) é uma piperazina sintética que vem sendo apreendida de forma crescente no mercado de drogas ilícitas, primeiro na Europa e, a partir de 2006, também no Brasil. Recentemente há relatos de aumento significativo da apreensão de comprimidos vendidos como ecstasy e que na realidade contêm mCPP, porém estudos sobre potenciais riscos dessa utilização à saúde ainda são escassos. O papel da mCPP como agonista de receptores serotoninérgicos já está bem descrito na literatura, razão pela qual esta substância é amplamente empregada em trabalhos científicos, principalmente psiquiátricos. No entanto, poucos são os trabalhos realizados com o intuito de investigar mais profundamente as ações desencadeadas no organismo pela substância em si. É sabido que a serotonina é um neurotransmissor liberado por plaquetas no local de inflamação e que exerce papel imunomodulatório importante sobre as células imune Assim, considerando (1) a relevância atual da mCPP no contexto de apreensão de drogas de abuso, (2) a necessidade de estudos sobre efeitos das drogas de abuso no organismo, (3) escassez de avaliações dos efeitos da mCPP sobre o sistema imunológico e (4) sua provável correlação com este sistema a partir de suas ações em receptores serotoninérgicos, o presente trabalho pretendeu iniciar investigações acerca da atividade da mCPP sobre as respostas imune inatas e sobre os mecanismos da mobilização leucocitária. Para tanto, ratos Wistar machos foram tratados com mCPP (1mg/kg, v.o.) e foram realizadas quantificações de leucócitos na medula óssea, no compartimento circulante e no foco inflamatório (peritônio), em presença ou ausência de estímulo inflamatório (LPS, 1 mg/mL, i.p.), como também da mieloperoxidase presente em tecido hepático, pulmonar e do baço. Complementando os estudos in vivo, ainda foi quantificada a cortisona plasmática em animais que receberam tal tratamento tendo seus receptores de glicocorticoides previamente antagonizados (RU38486). Neutrófilos coletados do exsudato peritoneal foram incubados nas concentrações de 10 µM, 100 µM e 1000 µM in vitro e investigados a migração neutrofílica, a expressão das moléculas de adesão na superfície neutrofílica, a quantificação de mediadores inflamatórios no sobrenadante de cultura de neutrófilos e o processo de adesão neutrófilo-endotélio, com células endoteliais coletados a partir do cremáster. Os resultados demonstram que a mCPP diminuiu a quantificação de leucócitos no exsudato peritoneal e, concomitantemente, aumentou o influxo de PMN para o tecido pulmonar, em vigência de estímulo inflamatório. Ainda, in vivo, não foi possível observar diferenças na concentração de cortisona sérica entre animais cujos receptores de glicocorticóides foram antagonizados e aqueles cujos receptores em questão encontravam-se normais. In vitro, a mCPP, nas três concentrações empregadas, e tanto na vigência quanto na ausência de estímulo (LPS ou fMLP), causou alterações na migração dos neutrófilos, na adesão deste tipo celular ao endotélio, na expressão de moléculas de adesão (Lselectina, β2-integrina e PECAM-1) na superfície neutrofílica e na quantificação das concentrações de mediadores inflamatórios (NO, IL-1β, IL-10, TNF-α) no sobrenadante de cultura de neutrófilos. Os resultados obtidos sugerem, em conjunto, que a mCPP exerce atividade pró-inflamatória no que se refere à atividade neutrofílica, bem como sugerem que o fármaco seja capaz de amplificar a resposta inflamatória em modelo animal de rato, tanto in vivo quanto in vitro. / The meta-chlorophenylpiperazine is a synthetic piperazine which has been seized increasingly in the illicit drug market, primarily in Europe and after 2006, in Brazil. Recently, there has been a significant increase on the apprehension of tablets sold as ecstasy but that in reality contain mCPP. Despite its importance, studies over its potential health risks are few. The mCPP role as serotonergic receptor agonist is well known in the literature, reason why this substance is widely employed in scientific research, particularly in psychiatric studies. But there are few reports that aim to investigate thoroughly the actions that this substance triggers in the organisms. It is also known that serotonin is a neurotransmitter released by platelets at the site of inflammation and plays important immunomodulatory role on immune cells. Therefore, considering (1) the relevance of mCPP in the drug abuse context nowadays, (2) the necessity of researching the effects of the drug abuse in the organisms, (3) the lack of studies containing analysis of the mCPP effects over the immune system and (4) the probable correlation between mCPP and this system, through its activity in serotoninergic receptors, this report intended to lead investigations about the mCPP activity over the innate immune response and over the leukocyte mobilization mechanisms. For this purpose, Wistar male rats were treated with mCPP (1mg/kg, v.o.), their leukocytes were measured in the bone marrow, in the circulating compartment and in the inflammatory foci (peritoneum) in the presence or absence of inflammatory stimuli (LPS, 1 mg/mL, i.p.) and the myeloperoxidase present in liver tissue, lung and spleen was also quantified. In addition to in vivo studies, the cortisone plasma was quantified in animals receiving such treatment with glucocorticoid receptors antagonized previously (RU38486). Neutrophils collected from the peritoneal exudate were incubated at concentrations of 10 mM, 100 mM and 1000 mM in vitro. It was then investigated the neutrophil migration and the expression of adhesion molecules on the surface of neutrophils as well as the quantification of inflammatory mediators in the culture supernatant. The process of neutrophil-neutrophil adhesion to endothelium was also analyzed and endothelial cells were collected from the cremaster. Results reflect that mCPP decreased the amount of leukocytes at the peritoneal exudate and, concomitantly, increased the influx of PMN into the lung tissue during an inflammatory stimulus. Also, in vivo, it was possible to observe differences in the concentration of serum from animals which cortisone glucocorticoid receptors were previously antagonized and those in which the receptors in question were normal. In vitro, mCPP in three concentrations employed, and both in the presence or absence of stimulus (LPS or fMLP) caused changes in the migration of neutrophils, in the cell adhesion to the endothelium, in the expression of adhesion molecules (L-selectin, integrin-β2 and PECAM-1), on the surface of neutrophils and in the concentrations of inflammatory mediators (NO, IL-1β, IL-10, TNF-α) in the culture supernatant of neutrophils. The results suggest that, together, mCPP exerts pro-inflammatory activity with respect to neutrophil activity. They also suggest that the drug is able to amplify the inflammatory response in an animal model rat both in vivo and in vitro.

Objetivo: Valorar si la elevación del Índice Neutrófilo - Linfocito (INL) se asocia a un mayor riesgo de aborto espontáneo en pacientes gestantes con y sin amenaza de aborto. Diseño: Se desarrollará una revisión sistemática y meta-análisis. Se utilizará la declaración Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses (PRISMA) como guía metodológica de publicación de la investigación. Asimismo, se considerarán las recomendaciones estipuladas en el Manual de Cochrane para la descripción de la metodología del estudio (34). Sumado a esto, se enviará el trabajo al Registro internacional prospectivo de revisiones sistemáticas (PROSPERO) con el fin de notificar el inicio de nuestra revisión sistemátic

Neutrófilos são a primeira linha de defesa do sistema imunológico, eles produzem substâncias microbicidas, tais como espécies reativas de oxigênio (ERO), são capazes de eliminar patógenos e possuem papel importante em processos inflamatórios fisiológicos e patológicos. No entanto, os efeitos benéficos e nocivos mediados por esta célula dependem, em grande parte, do equilíbrio redox, que se estabelece entre a produção de ERO e a ação de antioxidantes. A quebra deste equilíbrio leva ao estresse oxidativo, capaz de causar danos pelas ERO sobre as estruturas biológicas. Sendo assim, a regulação das funções dos neutrófilos é um importante alvo terapêutico. O objetivo deste trabalho foi avaliar a ação de produtos naturais - extrato bruto, frações e subfrações - oriundas da Antártica na regulação do metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos. Para este propósito, o extrato bruto da alga Palmaria decipiens, nove (9) frações do fungo endofítico Aspergillus unguis e nove (9) subfrações deste foram estudadas. As amostras foram avaliadas quanto à atividade scavenger, utilizando-se o 2,2-difenil-?-picrilhidrazil; à citotoxidade aos neutrófilos, por análise da viabilidade celular com o ensaio de exclusão do Azul de Trypan; e ao efeito sobre a produção de ERO pelos neutrófilos, medida por quimiluminescência dependente de luminol, utilizando-se forbol-12-miristato-13-acetato como estímulo para os neutrófilos. Os resultados mostraram que: 1) nenhuma das amostras apresentou atividade scavenger; 2) a viabilidade celular manteve-se igual ou maior que 90% quando neutrófilos foram expostos às frações FR5, FR6*, FR8, e às subfrações contendo 100% Acetato de Etila, 10% Acetato de Etila:Hexano, 20% Acetato de Etila:Hexano e 40% Acetato de Etila:Hexano; 3) dentre as frações que mostraram viabilidade celular maior que 90%, a inibição da produção de ERO pelos neutrófilos foi observada com a FR5 (51%), a FR6* (20%), a subfração 100% Hexano (73%), a subfração 20% Acetato de Etila/Hexano (42%) e a subfração 40% Acetato de Etila/Hexano (38%). Os resultados mostram que algumas das frações e subfrações do fungo endofítico Aspergillus unguis apresentaram inibição da produção de ERO pelos neutrófilos humanos entre (20 a 73%). Esta inibição não é por atividade scavenger de radiciais de oxigênio, sugerindo que este efeito regulador sobre o neutrófilo possa resultar da atividade dos componentes nestas frações sobre outras vias metabólicas desta célula. A partir destes resultados, faz-se necessário identificar a composição destas frações e seus efeitos sobre vias metabólicas e sobre outras funções efetoras dos neutrófilos. A contribuição deste estudo é a procura por moléculas bioativas, capazes de regular parcialmente as respostas do neutrófilo, para restabelecer o equilíbrio funcional desta célula em estados patológicos, diminuindo seus efeitos nocivos sem prejuízo do seu papel crucial para a homeostase. / Neutrophils are the first line of defense of the immune system, they produce microbicidal substances, such as reactive oxygen species (ROS), able to eliminate pathogens and play important roles in physiological and pathological inflammatory processes. However, the beneficial and harmful effects mediated by this cell depend on the redox balance, which is established between the production of ROS and the action of antioxidants. The imbalance leads to oxidative stress capable of causing damage by ROS on biological structures. Thus, the regulation of neutrophil functions is an important therapeutic target. The aim of this work was to evaluate the action of natural products - crude extract, fractions and subfractions - originating from Antarctica environment in the regulation of the oxidative metabolism of human neutrophils. For this purpose, the crude extract of the Palmaria decipiens algae, nine (9) fractions of the endophytic fungus Aspergillus unguis and nine (9) subfractions from this fungus were studied. The samples were evaluated for scavenger activity using 2,2-diphenyl-?-picrylhydrazyl; cytotoxicity to neutrophils, by cellular viability analysis with the Trypan Blue exclusion assay; and to the effect on neutrophil production of ROS, as measured by luminol-dependent chemiluminescence, using phorbol 12-myristate 13-acetate as a stimulus for neutrophils. The results showed that: 1) none of the samples had scavenger activity; 2) the cell viability remained equal to or greater than 90% when neutrophils were exposed to fractions FR5, FR6*, FR8, and subfractions containing 100% Ethyl Acetate, 10% Ethyl Acetate:Hexane, 20% Ethyl Acetate:Hexane and 40% Ethyl Acetate:Hexane; 3) among the fractions that showed cellular viability greater than 90%, the inhibition of ROS production by neutrophils was observed with FR5 (51%), FR6* (20%), subfraction 100% Hexane (73%), the subfraction 20% Ethyl acetate / Hexane (42%) and subfraction 40% Ethyl acetate / Hexane (38%). The results show that some of the fractions and subfractions of the endophytic fungus Aspergillus unguis showed inhibition of ROS production by human neutrophils between (20 to 73%). This inhibition is not by scavenger activity of oxygen radicals, suggesting that this regulatory effect on the neutrophil may result from the activity of the components in these fractions on other metabolic pathways of this cell. From these results, it is necessary to identify the composition of these fractions and their effects on metabolic pathways and on other effector functions of neutrophils. The contribution of this study is the search for bioactive molecules, able to partially regulate neutrophil responses, to restore the functional balance of this cell in pathological states, reducing its harmful effects without prejudice to its crucial role for homeostasis.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10767a.pdf: 1296672 bytes, checksum: 6f8ba558bac665a25fad4ca2e64a288c (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:43Z : No. of bitstreams: 2 Publico-10767a.pdf: 1296672 bytes, checksum: 6f8ba558bac665a25fad4ca2e64a288c (MD5) Publico-10767b.pdf: 1513875 bytes, checksum: b0bbfd84ceaf858aad2bc6c9a3aaa160 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introducao: O LPS induz a ativacao celular apos ligacao com CD14 e TLR4. A forma R de LPS (sem o polissacarideo O) pode ativar de forma independente de CD14. Neutrofilos e monocitos diferem de forma expressiva em sua expressao de CD14 na superficie. Objetivos: Comparar a acao biologica de formas R e S de LPS em neutrofilos e monocitos do sangue periferico de humanos. Metodos: A modulacao de receptores de superficie celular foi observada em monocitos e neutrofilos, e producao de especies reativas de oxigenios (EROs) e de oxido nitrico (NO), alem de ativacao de p38 e NFƒÈB foram avaliadas em neutrofilos por citometria de fluxo, apos incubacao com r e sLPS. Resultados: Houve uma pequena alteracao de TLR4 em monocitos com 6 h de incubacao, enquanto nenhuma modulacao foi vista para TLR2 em ambas as celulas. A modulacao de CD14 na superficie de monocitos mostrou-se bifasica, havendo incremento inicial na primeira hora seguida de queda com 6 h. Nao foi observada modulacao de CD14 na superficie de neutrofilos. Ambas as formas de LPS levaram a inducao de CD66b na superficie de neutrofilos, efeito que permanece pelo menos ate 24 h de incubacao. CD11b foi aumentado em neutrofilos e monocitos por r e sLPS, chegando ate 4 vezes a expressao depois de 3h, enquanto que a expressao CXCR2 cai em poucos minutos e permanece reduzida em neutrofilos. A expressao de HLADR foi aumentada nos monocitos no tempo de 3h. O efeito do sLPS na expressao de CD11b, CD66b e CXCR2 em neutrofilos mostrou-se um pouco mais precoce. Ambas as formas de LPS induziram pequena producao de NO e de EROs, quando comparadas com outros estimulos, assim como a translocacao de NFƒÈB p65 e p50 e ativacao de p38. Conclusoes: as formas R e S de LPS ativam similarmente os neutrofilos, apesar de sua baixa expressao de CD14 na superficie. Enquanto proteinas do soro podem otimizar a acao do LPS e sCD14 pode suprir a falta de CD14 em neutrofilos, e interacoes com monocitos podem ter seu papel na resposta dessas celulas ao LPS, e provavel que outros receptores estejam envolvidos na sinalizacao ao LPS em neutrofilos. Uma modulacao complexa de receptores de superficie foi vista em ambas as celulas com aumento ou decrescimo dependendo do receptor avaliado. / Objective: To compare the biological action of R form and S form LPS in human peripheral blood neutrophils and monocytes. Methods: Cell surface receptors modulation, ROS and NO production were evaluated on monocytes and neutrophils in whole blood, and NF-êB activation was evaluated in isolated neutrophils by flow cytometry after incubation with R and S-LPS. Results: A small enhancement of TLR4 expression was observed on monocytes with 6 h stimulation whereas no modulation of TLR2 was seen on either cell. Modulation of CD14 on monocytes was biphasic, with initial increment in the first hour followed by decreased expression at 6 h. Both LPS increased CD66b expression on neutrophils. Expression of CD11b was rapidly up-regulated on monocytes and neutrophils by both LPS, while down regulation of CXCR2 expression on neutrophils was observed after a few minutes, lasting for 6 h. S-LPS effect on neutrophils expression of CD11b, CD66b and CXCR2 receptors was a little earlier than the R-LPS effect. Both LPS induced low production of ROS and NO compared to other stimuli, as well as NF-êB translocation. Conclusions: A complex LPS-induced cell surface receptors modulation was seen on monocytes and neutrophils in human blood, with up and down regulation depending on the receptors evaluated. R for and S form LPS have similarly activated human neutrophils, despite the low expression of CD14 in those cells. While the presence of LBP and of sCD14 could provide the requirements for S-form LPS induction of neutrophils activity in whole blood, other receptors are also likely to be involved in LPS cell signaling in neutrophils. / FAPESP: 04/15584-2 / FAPESP: 05/58015-7 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-02T21:40:20Z No. of bitstreams: 1 RaphaelPaschoalSerquiz_DISSERT.pdf: 1610214 bytes, checksum: 8f23b4e10ee21479e603090f006e88c4 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-09T12:09:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RaphaelPaschoalSerquiz_DISSERT.pdf: 1610214 bytes, checksum: 8f23b4e10ee21479e603090f006e88c4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-09T12:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RaphaelPaschoalSerquiz_DISSERT.pdf: 1610214 bytes, checksum: 8f23b4e10ee21479e603090f006e88c4 (MD5) Previous issue date: 2017-10-25 / A hemostasia é o evento pelo qual os mamíferos bloqueiam a perda de volemias sanguíneas e promovem o reparo de lesões, e falhas por excessos contribuem para a propagação de fatores inflamatórios e trombóticos. As consequências da aterosclerose são exemplos de agravos desse tipo e a heparina (Hep) é um fármaco de escolha para esses tratamentos. Pacientes com carência de antitrombina têm resistência aos efeitos anticoagulantes da Hep, então pesquisas por novas moléculas homeostáticas que contribuam com os tratamentos clínicos são necessárias. Inibidores de proteinases vegetais têm sido eficazes em controlar processos biológicos, como coagulação e inflamação. O presente trabalho objetivou isolar um inibidor de tripsina da semente de Juquiri (JTI) verificando sua atividade contra serinoproteinases, e avaliar seus potenciais anticoagulante e anti-inflamatório. O inibidor foi isolado por cromatografia de afinidade e troca-iônica, apresentando duas principais bandas proteicas de 11,9 e 19,2 kDa estimadas por SDS-PAGE, e foi capaz de inibir tripsina e quimotripsina. Na coagulação, o JTI prolongou o tempo de tromboplastina parcial (APTT) em concentrações superiores à 2 µg/100 µL de plasma, sem prolongar o tempo de protrombina (PT). Associado à Hep, o JTI foi capaz de intensificar o efeito anticoagulante do fármaco em ambos os testes. Sem apresentar toxicidade contra eritrócitos humanos o JTI reduziu 40% das concentrações de elastase liberada por neutrófilos induzidos por PAF (fator ativador de plaquetas). O JTI em concentrações entre 20-80 µg/mL estimulou a produção de TNF por macrófagos RAW 264.7 em cultura sem provocar outros estímulos inflamatórios. Macrófagos ativados por LPS tiveram redução nas concentrações de NO, IL-6 e TNF quando tratados com JTI em concentrações entre 20-160 µg/mL. Estes dados apontam o JTI como promissor no tratamento de doenças trombóticas e inflamatórias, tendo sido eficaz como adjuvante da heparina e em promover a redução de estímulos inflamatórios de neutrófilos por vias provavelmente dependentes de MAPK, e em macrófagos por vias do fator de transcrição NF-κB. / Hemostasis is the event that mammals use to block the loss of blood and promote injury repair, and failure by overeating contributes to the spread of inflammatory and thrombotic factors. Atherosclerosis is an example of such diseases, and heparin (Hep) is a treatment drug. Patients with antithrombin deficiency have resistance to the anticoagulant effects of Hep, so researches for novel homeostatic molecules that contribute to clinical treatments are necessary. Plant protease inhibitors have been effective in controlling biological processes, such as coagulation and inflammation. The present work aimed isolate a trypsin inhibitor from the Juquiri (JTI) seed and evaluate its activity against serine proteases, and its anticoagulant and antiinflammatory potentials. JTI was isolated by affinity and ion exchange chromatography, presenting two major protein bands of 11.9 and 19.2 kDa on SDSPAGE, and was able to inhibit trypsin and chymotrypsin. In coagulation, JTI prolonged partial thromboplastin time (APTT) at concentrations greater than 2 μg/100 μL plasma, without prolonging prothrombin time (PT). Associated with Hep, JTI was able to enhance the anticoagulant effect of the drug in both tests. Without toxicity to human erythrocytes, JTI reduced 40% of elastase concentrations released by neutrophils induced by platelet activating factor (PAF). JTI at concentrations between 20-80 μg/mL stimulated TNF production by macrophages (RAW 264.7) in culture without provoking other inflammatory stimuli. LPS-activated macrophages had a reduction in NO, IL-6 and TNF productions when treated with JTI at 20-160 μg/mL concentrations. These data point to JTI as promising in the treatment of thrombotic and inflammatory diseases and have been effective as heparin adjuvant and to promote the reduction of neutrophil inflammatory stimuli likely by MAPK-dependent pathways and in macrophages by NF-κB transcription factor pathways.

Ácido clorogênico (ACG) é o termo utilizado para designar um grupo de compostos fenólicos oriundos da reação de esterificação entre ácidos hidroxicinâmicos (p-cumárico, caféico e ferúlico) e ácido quínico. São amplamente encontrados em produtos naturais e exercem ações antioxidantes, citotóxicas, antitumorais, antibacterianas, antifúngicas e antiinflamatórias. Apesar da descrição dos seus efeitos antiinflamatórios em diferentes modelos experimentais, a literatura é carente quanto suas ações específicas em funções inflamatórias de neutrófilos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos do ACG sobre funções de neutrófilos in vitro. Neutrófilos foram obtidos do lavado peritoneal de ratos Wistar, machos, 4 horas após a injeção local de glicogênio de ostra a 1% e foram incubados, na presença ou ausência de LPS, com ACG nas concentrações de 25, 50, 100 ou 1000 µM. A viabilidade celular (exclusão por trypan-blue), a secreção de citocinas e prostaglandina E2 (ensaio imunoenzimático); a produção de óxido nítrico (reação de Griess); a expressão de moléculas de adesão (citometria de fluxo); a aderência e a quimiotaxia foram avaliadas. Os resultados obtidos mostraram que o ACG não afetou as secreções do fator de necrose tumoral-α,de interleucina 1β, do óxido nítrico e de prostaglandina E2 em condições basais ou após estimulação pelo LPS. Diferentemente, a incubação com ACG inibiu a aderência de neutrófilos à cultura primária de célula endotelial de microcirculação de ratos e a quimiotaxia in vitro frente ao peptídeo formilado (N-formilmetionil- leucil-fenilalanina). Estes últimos efeitos podem estar associados à ação do ACG sobre a expressão de moléculas de adesão, já que o ACG elevou a expressão de L-selectina e reduziu as expressões de β2 integrina e da molécula de adesão plaqueta e endotélio. Os dados obtidos não foram dependentes de alterações da viabilidade celular. Em conjunto, os resultados mostram que o ACG possui efeito direto sobre funções de neutrófilos responsáveis pela interação ao endotélio microvascular e pela migração orientada em resposta a estímulo inflamatório. Estes efeitos podem contribuir, pelo menos em parte, para redução da migração de neutrófilos para focos de inflamação na vigência de tratamento com ACG amplamente descrita na literatura. / Chlorogenic acid (CGA) is the term utilized to design a group of phenolic compounds from the sterification reaction between the hydroxycinnamic acids (p-coumaric, caffeic and ferulic acid) and the quinic acid. They are largely found in natural products and exert anti-oxidant, citoxic, anti-tumoral, anti-bactericidal, anti-fungicidal and anti-inflammatory activity. Besides the description of its anti-inflammatory effect in different experimental models, the literature is scarse regarding its specific actions in neutrophil inflammatory functions. Therefore, the aim of this present work was to investigate the CGA effects on neutrophils functions in vitro. Neutrophils were obtained from the peritoneal lavage of male Wistar rats four hours after a local injection of oyster glycogen 1% and were incubated, in the presence or absence of LPS, with CGA in the concentrations of 25, 50, 100 or 1000 µM. The cellular viability (trypan-blue exclusion), the cytokines secretions (enzyme-linked immunosorbend assay), production of nitric oxide (Greiss reaction); adhesion molecules expression (flow citometry), adherence and chemotaxis in vitro were assessed. The results shows that the CGA did not affect the secretion of the tumor necrosis factor-α , of nitric oxide and prostaglandin E2 and only the incubation with 50µM of CGA inhibited the secretion of Interleukin 1β after stimulation with LPS. Differently, the incubation with CGA inhibited the adherence of neutrophils on the primary culture of endothelial cell from the micro-circulation of rats and the chemotaxis in vitro against formylated peptide (fenyl-metyl-leucyl-alanin). This lasts effects might be associated with the action of CGA on the expression of adhesion molecules, hence this compound was capable of elevate the expression of L-selectin and reduce the expression of β2 integrin and PECAM-1. The data here obtained are not dependent of cellular viability alterations. In conjunct, the data here obtained shows that the CGA has direct effect on neutrophils functions responsible of the interaction with the micro vascular endothelium and the oriented migration in response to an inflammatory stimuli. These effects can contribute, at least in part, to the decreased neutrophil migration in the inflammatory focus in the presence of CGA treatment.

Neste estudo caracterizamos a inflamação pulmonar aguda decorrente da I/R intestinal em camundongos geneticamente selecionados para baixa (AIRmin) ou alta (AIRmax) reatividade inflamatória aguda os quais foram obtidos por Seleção Genética Bidirecional. Paralelamente, camundongos da linhagem Balb/c foram utilizados, como referência dos parâmetros investigados. A isquemia intestinal foi induzida pela obstrução da artéria mesentérica superior (AMS) por 45 min seguida de sua desobstrução. Após 4 h de reperfusão intestinal a inflamação pulmonar foi avaliada por meio da atividade pulmonar de mieloperoxidase (MPO), número de leucócitos (no sangue, na medula óssea e no baço), permeabilidade vascular, dosagem de citocinas (IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, IL-6 e TNF-<font face=\"symbol\">a) e a produção de nitratos e nitritos em cultura de ex-vivo de tecido pulmonar (explante). A I/R-intestinal induziu aumento da atividade MPO (mieloperoxidase), aumento da permeabilidade vascular pulmonar e neutrofilia nas três linhagens estudadas, com maior intensidade em camundongos AIRmax. A celularidade da medula óssea e baço não foi afetada pela I/R intestinal nas linhagens AIRmin e AIRmax. A I/R intestinal aumentou a atividade de MPO intestinal nas linhagens Balb/c, AIRmin e AIRmax, porém este parâmetro não diferiu dentro das linhagens estudadas. Por outro lado, o intestino não desenvolveu aumento de extravasamento plasmático. O explante pulmonar de animais AIRmax geraram níveis significativamente elevados de nitratos e nitritos após a I/R-intestinal. A quantidade de citocinas produzidas espontaneamente pelo explante pulmonar não diferiu entre as linhagens AIRmin e AIRmax. Todavia, na vigência de estímulo secundário (lipopolisacarídeo), a produção de IL-1<font face=\"symbol\">b e IL-10 foi maior na linhagem AIRmax. A taxa de mortalidade após I/R intestinal não difere entre as linhagens AIRmin e AIRmax, todavia na linhagem AIRmin as mortes ocorrem mais precocemente (4h) após a I/R intestinal, em contraste aquela encontrado nos animais de AIRmax (12h). Concluindo, nossos dados permitem sugerir que os animais geneticamente selecionados reagem diferentemente após a I/R intestinal, de modo que os animais AIRmin mostram uma sensibilidade realçada (nos termos da taxa de mortalidade), e em contrapartida os animais AIRmax um maior reatividade (nos termos da resposta inflamatória para I/R). Contudo, nós sugerimos que as alterações genotípicas devido à seleção podem explicar uma exacerbada resposta inflamatória para I/R em camundongos AIRmax coexistindo com um perfil mais favorável de letalidade visto que o oposto é observado em animais de AIRmin. / The aim of this study was to characterize the acute lung inflammation due to intestinal I/R in mice selected for high (AIRmax) or low (AIRmin) acute inflammatory response by means of bidirectional genetic selection. Balb/c mice were also used as a reference control of the parameters evaluated. Intestinal ischemia was induced by a 45-min clamping of the superior mesenteric artery; the clamping was then released and the lung inflammation was evaluated after a 4-h reperfusion period by measurements of myeloperoxidase (MPO) lung activity, leukocyte number (in blood, bone marrow and spleen), vascular permeability, cytokines (IL-1<font face=\"symbol\">b, IL-10, IL-6 and TNF-<font face=\"symbol\">a) and production of nitrates and nitrites in lung tissue ex vivo cultures (explants). Intestinal I/R induced an increase of the lung acute inflammatory reaction as judged by the increase of MPO activity and of vascular permeability and the influx of neutrophils in every animallineage studied, being the AIRmax mice the most reactive ones. However, the cellularity of the bone marrow and spleen was not affected by intestinal I/R in AIRmax or AIRmin mice. Intestinal I/R caused an increase of MPO activity in the gut of Balb/c, AIRmax and AIRmin mice, with no differences from each other. On the other hand, no intestinal plasma extravasation was noticed. Nitrites and nitrates production was higher in cultures of AIRmax mice lung explants after intestinal I/R. The spontaneous production of cytokines was not different among AIRmax and AIRmin lung explants, being significantly increased in AIRmax samples upon bacteriallipopolysaccharide (LPS) stimulation(IL-1<font face=\"symbol\">b e IL-10). The profile of mortality among AIRmax and AIRmin was not altered by intestinal I/R. However, the mortality rate of injured AIRmin mice was found as early as 4 h after intestinal I/R, in contrast with that found in AIRmax animals (12 h after). In conclusion, our data suggest that genetically selected AIRmax and AIRmin mice react differentially to intestinal I/R, so that AIRmin mice show enhanced sensitivity (in terms of mortality rate), and their AIRmax counterparts show enhanced responsiveness (in terms of inflammatory response to I/R). Overall, we suggest that the genotypic changes due to selection may explain why an exacerbated inflammatory response to I/R in AIRmax mice coexists with a more favorable profile oflethality, whereas the opposite is seen in AIRmin animals.

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que se apresenta na forma de hifa a 25?C e forma de levedura a 37?C. Após inalação de conídios e propágulos de hifas presentes no ambiente, o fungo encontra no hospedeiro as condições ideais para transição em levedura, capaz de causar a doença paracoccidioidomicose (PCM), primariamente pulmonar, podendo ser seguida de disseminação sistêmica. O processo infeccioso é caracterizado pelo reconhecimento de constituintes de leveduras por receptores de células do sistema imune, especialmente fagócitos, que são ativados e produzem citocinas. Neutrófilos são as primeiras células recrutadas para o local da infecção, onde combatem o patógeno, fagocitando-o e liberando mediadores e efetores, como citocinas, ROS (Espécies Reativas de Oxigênio) e NETs (Armadilhas extracelulares de neutrófilos). Esses eventos, além de fatores ambientais e genéticos, têm influência sobre a resistência do hospedeiro ao fungo e, consequentemente, sobre a progressão da doença. Um aspecto da epidemiologia da doença impressiona: a incidência de PCM é mais alta em homens do que em mulheres, especialmente na idade reprodutiva. Especula-se que a melhor resposta das mulheres ao fungo possa relacionar-se à maior concentração de estrógeno, uma vez que esse hormônio, in vitro, inibe a transição de hifa em micélio. Adicionalmente, nosso grupo verificou, em modelo murino de PCM, que machos e fêmeas divergem quanto à resposta imunitária frente ao fungo, favorecendo a resistência de fêmeas. Todavia, neutrófilos, a despeito de sua aparente relevância em infecções fúngicas, nunca foram estudados quanto ao eventual papel na determinação de diferenças de gênero constatadas na PCM. Este trabalho teve como objetivo comparar neutrófilos de homens e mulheres quanto às funções reguladoras e efetoras, quando essas células são infectadas in vitro com leveduras de P. brasiliensis (multiplicidade de infecção (MOI) 5:1). Participaram do estudo 38 homens e mulheres saudáveis, com idade entre 23 e 35 anos. Como critério de inclusão no estudo, as mulheresIX deveriam estar entre o primeiro e o 15º dia do ciclo menstrual ou utilizarem anticoncepcional à base de estrógeno na data da coleta. Os neutrófilos, purificados a partir do sangue periférico e incubados com leveduras de P. brasiliensis e, estudados quanto às habilidades de fagocitose e eliminação de leveduras, produção de citocinas e ROS desenvolvidas por células oriundas de homens e mulheres. Os resultados indicam que os neutrófilos de mulheres mataram o fungo com maior eficiência e produziram maiores concentrações de TNF. Entretanto, dentre as funções neutrofílicas testadas, algumas não foram afetadas pelo gênero do doador, como a habilidade de fagocitose e a produção de ROS. Alguns ensaios foram precedidos da adição ao meio de ?-estradiol sintético. Na presença do hormônio sintético, verificamos que (i) neutrófilos de homens limitaram o crescimento fúngico de maneira mais eficiente; (ii) neutrófilos de homens e mulheres diminuíram a produção de TGF-?. Concluímos que há diferenças entre funções de neutrófilos oriundos de homens e de mulheres frente à infecção por P. brasiliensis. Parte dos déficits funcionais detectados em neutrófilos de homens frente à infecção fúngica foi revertida pela adição de estrógeno ao meio em que se procederam os ensaios. As observações feitas neste trabalho permitem postular que os neutrófilos, sob efeito do estrógeno, contribuem para que as mulheres sejam mais resistentes à PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that appears as hyphae at 25 ° C and yeast at 37 ° C. After inhalation of conidia and propagules of hyphae resident in the environment, the fungus finds in the host the ideal conditions for transition in yeast, capable of causing the disease Paracoccidioidomycosis (PCM), primarily pulmonary, and may be followed by systemic dissemination. The infectious process implies in recognition of fungal constituents by immune cell receptors, especially phagocytes, which are activated. Neutrophils, the first recruited cells to the infection focus, fight the pathogen and initiate cytokines\' releasing and effector events, such as reactive oxygen species (ROS) production and extracellular traps (NETs) formation. Together, they influence the host resistance to the fungus and, consequently, the disease course. One aspect of the PCM epidemiology is impressive: its incidence is higher in men than in women, especially during their reproductive period. It is speculated that the women\'s better response to the fungus may be related to the estrogen higher concentration they have, since this hormone, in vitro, inhibits the yeast\'s growth. Additionally, our group has previously reported that in a murine PCM model, males and females differ on the immune response to the fungus, which favors the females\' resistance. However, neutrophils, despite their apparent relevance in fungal infections, have never been studied for their possible contributive role in the gender differences found in PCM. This work aimed to compare the neutrophils regulatory and effector functions in men and women when these cells were in vitro infected with P. brasiliensis yeasts. Healthy men and women aged between 23 and 35 have participated in the study. To be included, at the date of neutrophil harvesting women should be between the first and the 15th day of the menstrual cycle or use estrogen-based contraceptives. Neutrophils purified from peripheral blood were incubated with P. brasiliensis and assessed for the capacity of phagocytosis and elimination of yeasts, as well asXI for the production of cytokine and ROS. Neutrophils from women killed the fungi more efficiently and produced higher concentrations of TNF. Nonetheless, the donor gender has not affected some tested neutrophil functions, namely phagocytosis ability and ROS production. Moreover, assays performed in the presence of synthetic ?-estradiol showed that (i) men neutrophils started to kill yeasts more efficiently than in the absence of the hormone; (ii) neutrophils from men and women decreased the production of TGF-?. We conclude that in vitro infection with P. brasiliensis unveiled differences between men and women neutrophils\' functions. Part of the functional insufficiency verified in men\'s neutrophils of fighting against the fungal infection reversed by the estrogen addition to the assay medium. The results of this work allow postulating that neutrophils contribute to the women\'s resistance to paracoccidioidomycosis.