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Previous issue date: 2011-03-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancer de prostata e o segundo tipo de cancer mais frequente. Calicreinas teciduais e integrinas estao diretamente relacionadas com essa doenca, interferindo na adesao celular, diferenciacao e proliferacao. Neste trabalho utilizamos as linhagens estabelecidas DU145 e PC3 de cancer de prostata para o estudo do efeito do inibidor de calicreina recombinante, rBbKIm, o qual contem em sua sequencia primaria o motivo RGD, proveniente do inibidor BrTI isolado de Bauhnina rufa. O meio condicionado da cultura de DU145 e PC3 tratadas com rBbKIm por 48 horas inibiu cerca de 95% a atividade hidrolitica de HD-Pro-Phe-Arg- ƒÏNa por serino proteases da familia das calicreinas. rBbKIm inibiu a viabilidade celular da DU145 (56%, 100 ƒÊM, 48 horas) e da PC3 (28%, 100 ƒÊM, 48 horas) e interferiu somente em 5% da viabilidade da linhagem de fibroblastos de liquido amniotico (100 ƒÊM, 48 horas). rBbKIm nao inibiu a adesao das linhagens DU145 e PC3 sobre a fibronectina, laminina, colageno I e IV. Embora rBbKIm nao tenha interferido na migracao de DU145 o inibidor reduziu em 38% o processo migratorio da linhagem PC3 (100 ƒÊM) apos 23 horas de tratamento. Em relacao ao efeito do inibidor sobre a morte celular DU145 e PC3 tratadas com de rBbKIm (50 e 100 ƒÊM, 24 e 48 h) induziu a morte celular por apoptose. Alteracoes no ciclo celular foram observadas na linhagem PC3 com parada do ciclo nas fases G0/G1 e G2/M. Nao houve alteracao no ciclo celular na linhagem DU145. Ambas as celulas externalizaram o citocromo c para o citoplasma quando tratadas com rBbKIm (50 e 100 ƒÊM) por 24 horas. No caso da PC3 observou-se a ativacao de caspase-9 com 50 ƒÊM de rBbKIm apos 48 horas, nao havendo ativacao de caspase-3 enquanto que com a DU145 ocorreu ativacao da caspase-3 e nao houve ativacao da caspase-9. Os peptideos contendo a sequencia RGD e RGE nao inibiram a viabilidade celular de DU145 e PC3. Analises sobre o efeito de rBbKIm na viabilidade e migracao da linhagem endotelial humana (HUVEC), mostrou que rBbKIm (50 ƒÊM) inibiu 28% da viabilidade celular e 30% da motilidade celular da HUVEC. rBbKIm tambem apresentou atividade inibitoria na formacao de estruturas angiogenicas sobre Matrigel in vitro. Em resumo, o presente trabalho demonstrou a ação diferencial do inibidor de protease rBbKIm em linhagens de câncer de próstata independentes de andrógenos, PC3 e DU145, e em células normais de fibroblastos de líquido amniótico e em células endoteliais humanas, HUVEC. / Prostate cancer is the second more frequent type of cancer. In this work, using DU145 and PC3 prostate cancer cellular lines, we studied the effect of recombinant kallikrein inhibitor modified form (rBbKm), in which the sequence containing the signal motif sequence RGD of the inhibitor BrTI from Bauhnina rufa was inserted. When DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm for 48h, and the conditioned medium the culture was incubated with the HD-Pro-Phe-Arg-ñNa, an kallikrein substrate, inhibited 95% of the degradation of this in both cells. rBbKIm inhibited cell viabillity of DU145 (56%, 100 ìM, 48 h) and PC3 (28%, 100 ìM, 48 h), but affect only 5% of the viabillity of fibroblast normal cell line (100 ìM, 48h). In cell adhesion, rBbKIm did not inhibit DU145 and PC3 cell line adhesion on fibronectin, laminin, collagen I and IV coat. In cell migration, rBbKIm did not inhibit DU145, but inhibited 38% of the PC3 (100 ìM) after 23 h. To evaluate the cytotoxicity, DU145 and PC3 were incubated with rBbKIm (50 and 100 ìM, 24 and 48h) inducing cell death by apoptosis. The presence of rBbKIm arrest PC3 cell cycle at the G0/G1 and G2/M phase, but did not affect DU145. Both cells released cytocrome c to the cytosol when treated with rBbKIm (50 and 100 ìM) for 24h. Moreover, DU145 when was treated with rBbKIm for 48h activated the caspase-3. However PC3 did not activated caspase-3, but activated caspase-9. The peptides containing the RGD and RGE sequence did not inhbit the cell viabillity of DU145 and PC3. Analyzing the effect of rBbKIm on HUVEC viabillity and migration, rBbKIm (50ìM) inhibited 28% and 30%, respectively. This protein inhibited 49% of the HUVEC angiogenesis in vitro on Matrigel. In summary, we have demonstrated the differential action of the protease inhibitor rBbKIm on androgen-independent prostate cancer PC3 and DU145, normal fibroblast and endothelial HUVEC cells. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/8865 |
Date | 30 March 2011 |
Creators | Ferreira, Joana Gasperazzo [UNIFESP] |
Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Oliva, Maria Luiza Vilela [UNIFESP] |
Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
Language | Portuguese |
Detected Language | English |
Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
Format | 192 p. |
Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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