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Previous issue date: 2016-08-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Chagas Disease is a sickness that affects the population present of Latin America and it is
classified by the World Health Organization as a Neglected Tropical Diseases. Chagas disease is caused by the flagellated parasite Trypanosoma cruzi, which belong to the same family as Trypanosoma brucei and Leishmania sp., and has a complex life cycle, going from an
invertebrate host to a vertebrate one. In order to survive and proliferate in these host changes, T. cruzi must adapt itself to osmotic and oxidative stresses, changes in the environmental ion composition and shifts in energy sources. To perform this adaptation, the amino acid Lproline has presented an important and essential participation that affects the protozoan life cycle, such as support of the mitochondrial metabolism, the host-cell invasion and metacyclogenesis. T. cruzi 1-Delta-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydrogenase (TcP5CDH) is involved in the catabolism of proline holding a major role in its conversion by transforming pyrroline-5-carboxylate into L-glutamate (the second step of the catabolic path) and, thus, seeming to be a promising molecular target for new drug development. The amino acids sequence of PP5CDH was used for conservation analysis, secondary structure prediction, identification of functional domains, and building of tertiary structure computer models with the techniques of Molecular Modeling and Molecular Docking. The TcP5CDH (MW: 60 kDa) was expressed in a heterologous fashion in Escherichia coli, and purified with affinity and size exclusion chromatography, resulting in approximately 2 mg/L of expression. The Dynamic Light Scattering assays where carried out with the recombinant P5CDH in the concentrations of 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 mg/mL, and presented an apparent molecular weight of 223,4 kDa (Rh: 12,01 nm), 246,4 kDa (Rh: 12,53 nm), 310,5 kDa (Rh: 13,83 nm) e 312,0 kDa (Rh: 12,13,86 nm), respespectively. The Circular Dichroism spectroscopy was performed with 0.2 mg/mL of TcP5CDH in the presence and absence of 100 μM of NAD+, L-Glu, and its inhibitor Disulfiram, presenting a Tm of Tm 60,01 ºC, 59,76 ºC, 57,76 ºC e 58,18 ºC, showing that TcP5CDH has a more thermic stability without ligands. Also, a deconvolution was made showing that TcP5CDH has 23% of alfa-helix, 12,3% of antiparallel beta-sheetst and 12,4% parallel beta-sheets, 18,3% of turns 41,7% of disorganized structures. These results will contribute to the understanding of the pathway of L- proline in T. cruzi and the possible future development of new drugs. / A Doença de Chagas é uma enfermidade que afeta a população presente nos países da
América Latina e é classificado pela Organização Mundial da Saúde como uma Doença Tropical Negligenciada. A Doença de Chagas é causada pelo parasita flagelado Trypanosoma cruzi, pertencente à mesma família dos parasitas Trypanosoma brucei e a Leishmania sp., organismo que possui um complexo ciclo de vida, passando de um hospedeiro invertebrado para um vertebrado. Para sobreviver e proliferar nessa mudança de hospedeiro, o T. cruzi precisa se adaptar a estresses oxido-redutivos e osmóticos, mudanças da composição iônica do
ambiente e mudanças na fonte de energia. Para realizar essas mudanças, o aminoácido Lprolina apresenta uma importante participação que afeta o ciclo de vida do parasita como suporte no metabolismo mitocondrial, invasão de células hospedeiras e na metaciclogênese. A 1-Delta-Pyrrolina-5-Carboxilato Desidrogenase de T. cruzi (TcP5CDH) está envolvida no catabolismo da prolina tendo um papel importante na sua conversão através da transformação da pirroline-5-carboxilato em L-glutamato (a segunda etapa da via) e, assim, parece ser um alvo molecular promissor para desenvolvimento de novos fármacos. A sequência de aminoácidos da P5CDH foi utilizada para análises de conservação, predição de estruturas secundárias, identificação de domínios funcionais e modelos computacionais da estrutura terciária através da técnicas de Modelagem por Homologia e Ancoramento Molecular. A TcP5CDH (MW: 60 kDa) foi expressa de forma heteróloga em Eschericia coli, purificada por cromatografia de afinidade e cromatografia de exclusão molecular e, em seguida, concentrada, resultando em aproximadamente 2 mg/L de expressão. Os experimentos de Espalhamento Dinâmico da Luz foram realizados com a P5CDH recombinante nas concentrações de 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 mg/mL e apresentaram uma massa molecular aparente de 223,4 kDa (Rh: 12,01 nm), 246,4 kDa (Rh: 12,53 nm), 310,5 kDa (Rh: 13,83 nm) e 312,0 kDa (Rh: 12,13,86 nm), respectivamente. A Espectroscopia de Dicroísmo Circular foi realizado utilizando 0,2 mg/mL da TcP5CDH e com a proteína na presença de 100 μM de NAD+, L-Glu e do inibidor Dissulfiram, apresentando uma Tm 60,01 ºC, 59,76 ºC, 57,76 ºC e 58,18 ºC, respectivamente. Além disso, uma deconvolução foi realizada mostrando que a TcP5CDH possui 23% de alfa-hélices, 12,3% de folhas-beta antiparalelas, 12.4% de folhas-beta paralelas, 18,3% de voltas e 41,7% de regiões desorganizadas Estes resultados irão contribuir no entendimento da via da L-prolina em T. cruzi e no possível desenvolvimento futuro de novos fármacos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/8415 |
| Date | 28 August 2016 |
| Creators | Moraes, Alan Raphael de Farias Klein |
| Contributors | Thiemann, Otávio Henrique |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Genética Evolutiva e Biologia Molecular, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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