Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-28112013-152606 |
| Date | 22 August 2013 |
| Creators | Moraes Filho, Jonas |
| Contributors | Labruna, Marcelo Bahia |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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