Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T15:41:20Z No. of bitstreams: 1 Rayssa Maria de Araujo Carvalho Estudo da coinfecção...2015.pdf: 2144928 bytes, checksum: 48b23a40107abab111363e306597b10d (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2016-02-04T15:41:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Rayssa Maria de Araujo Carvalho Estudo da coinfecção...2015.pdf: 2144928 bytes, checksum: 48b23a40107abab111363e306597b10d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-04T15:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rayssa Maria de Araujo Carvalho Estudo da coinfecção...2015.pdf: 2144928 bytes, checksum: 48b23a40107abab111363e306597b10d (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Medicina. Salvador, BA, Brasil / A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) e a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) são duas doenças, transmitidas por vetores, com ampla distribuição mundial. Os agentes causadores dessas doenças são Ehrlichia canis e Leishmania infantum, respectivamente. Enquanto a EMC é transmitida por carrapatos, principalmente Rhipicephalus sanguineus, a Leishmania é inoculada no hospedeiro através do inseto-vetor da subfamilia Phlebotominae. A maioria dos sinais físicos são comuns às duas enfermidades, o que dificulta o diagnóstico clínico e o tratamento, especialmente em áreas endêmicas. Poucos são os estudos relacionados à coinfecção da erliquiose e leishmaniose caninas no Brasil. No Piauí, particularmente em Teresina, ainda não se tem dados concretos sobre a prevalência dessas afecções.Os sinais físicos variam com a severidade da infecção, a resposta imune do hospedeiro e a presença de coinfecção. Assim, buscamos avaliar cães, independente dos sinais físicos, atendidos no hospital universitário e clínicas particulares da cidade de Teresina, Piauí quanto a frequência de erliquiose e leishmaniose caninas no período de março de 2012 a setembro de 2014, independente de sexo, raça, idade e suspeita clínica, excetuando os cães que vinham apenas para vacinação. Foi realizado exame clínico e colhidas amostras sanguíneas para exame hematimétrico, bioquímico, parasitológico e molecular. Dos 664 cães avaliados para E. canis, 22,9% tiveram o DNA amplificado somente para esta bactéria. No caso de Leishmania infantum, houve amplificação de DNA em 29,1% dos 664 cães, sendo que, destes, 80 (12,1%) estavam coinfectados com E.canis. Anemia e trombocitopenia foram as principais alterações hematológicas observadas em cães infectados tanto com E. canis, como com L. infantum e coinfectados. As principais alterações bioquímicas nos cães com infecção apenas por L. infantum, assim como nos coinfectados, foram hipoglobulinemia e hiperproteinemia. Já nos monoinfectados por E. canis a hipoalbuminemia e a uremia foram as principais alterações. Perda de peso, úlceras, apatia, conjuntivite, palidez nas mucosas, alópecia e linfoadenomegalia são mais frequentes em cães monoinfectados com L. infantum do que nos infectados apenas com E. canis. Além disso, os cães coinfectados apresentam uma doença mais severa do que os monoinfectados. Concluímos que a presença da coinfecção por esses agentes infecciosos é endêmica na cidade de Teresina-Piauí e que existe um sinergismo entra as duas doenças.Portanto, destacamos aqui a relevância dos estudos voltados a epidemiologia e melhoria dos testes diagnósticos para uma prevenção e/ou controle mais eficazes dessas doenças. Palavras / The Canine Monocytic Ehrlichiosis (CME) and Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) are the two vector-borne diseases with worldwide distribution. The causative agents of these diseases are Ehrlichia canis and Leishmania infantum, respectively. While CME is transmitted by ticks, especially Rhipicephalus sanguineus, Leishmania is inoculated into the host through the insect vector of the subfamily Phlebotominae. Most clinical signs are common to both conditions, which hinders the clinical diagnosis and treatment, especially in endemic areas. There are few studies related to the coinfection of canine ehrlichiosis and leishmaniasis in Brazil. In Piaui, particularly in Teresina, there is not yet concrete data on the prevalence of these diseases. The clinical signs vary according to the severity of the infection, to the host immune response and to the presence of coinfection. Thus, we sought to evaluate dogs, regardless of clinical signs, seen at university hospital and private clinics in the city of Teresina, Piauí, for the frequency of canine ehrlichiosis and leishmaniasis from March 2012 to September 2014, regardless of sex, race, age and clinical suspicion, except dogs that came just to vaccination purposes. Clinical examination was performed and blood samples for erythrocyte examination, biochemical, and molecular parasitology were collected. From 664 dogs evaluated for E. canis, 22, 9% showed amplified DNA, to this bacterium only . Regarding to Leishmania infantum, there was DNA amplification in 29, 1% out of the 664 dogs, and, from these, 80 (12, 1%) were coinfected with E. canis. Anemia and thrombocytopenia were major hematologic changes observed in dogs infected with Leishmania, E.canis and coinfected dogs. The main biochemical findings in dogs infected by L. infantum and coinfected were hyperalbuminemia, hypoglobulinemia and hyperproteinemia. In those infected only by E. canis, hypoalbuminemia and uremia were the main changes. Weight loss, skin lesions, lethargy, conjunctivitis, pale mucous membranes, alopecia and enlarged lymphnodes are more common in dogs with L. infantum than in dogs infected only with E.canis. In addition, the coinfected dogs have a more severe disease than the ones with only one infection. We conclude that the presence of coinfection by these infectious agents are endemic in the city of Teresina, Piauí, and that there is a synergism between the two diseases. Therefore, we highlight here the relevance of studies regarding epidemiology and improvement of diagnostic tests for prevention and / or control of the diseases in a more effective way.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-27Bitstream added on 2014-06-13T20:11:33Z : No. of bitstreams: 1 rondelli_mch_me_jabo.pdf: 1021961 bytes, checksum: 86f21b8998af136aaf5ef78e0fdec164 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A erliquiose em cães pode conduzir o animal ao óbito, tanto por alterações hematológicas quanto clínicas, que se explicam pelo caráter catabólico multifatorial da doença. O comprometimento adrenocortical pode ser esperado em virtude dos desafios impostos ao sistema imune, gerados pelas infecções e inflamações. Este estudo visou avaliar a ocorrência de alterações hormonais relacionadas às glândulas adrenais, em cães infectados naturalmente por Ehrlichia canis (n=21), positivos na identificação de anticorpos anti-E.canis (Dot-ELISA) e DNA da bactéria (nPCR). Para tanto, foram pesquisadas as concentrações séricas de cortisol, sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e proteínas de fase aguda (proteína C reativa e haptoglobina) pré e pósestimulação com o hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), e comparadas com os valores obtidos de cães saudáveis (n=10). Os resultados demonstraram resposta semelhante dos cães doentes e saudáveis ao teste de estimulação com ACTH, no que concerne ao cortisol. Isto sugere que cães com erliquiose de ocorrência natural mantêm a capacidade de secretar cortisol adequadamente diante o estímulo do ACTH. As concentrações de DHEA-S foram significativamente mais elevadas nos cães doentes, nos momentos pré e pós-ACTH, em relação aos saudáveis, o que ilustra o estresse do organismo na doença em estudo. Não foram observadas diferenças significativas entre os momentos dentro de cada grupo. Aparentemente, a estimulação com ACTH não interferiu na concentração de DHEA-S dosado uma hora após sua administração, sugerindo que a resposta ao estímulo hormonal não foi detectada. Da mesma forma, a estimulação com ACTH não interferiu na concentração das proteínas de fase aguda, embora se apresentassem significativamente... / Ehrlichiosis in dogs may lead to death both for hematological and for clinical alterations that might be explained for its multifactorial catabolic character. The adrenocortical disruption may be expected during the course of the disease due to challenges on the immune system, generated by infection and inflammation. This study aimed to evaluate the occurrence of hormonal disturbances associated to the adrenal glands in dogs naturally infected by Ehrlichia canis (n=21), positive at the identification of anti-E. canis antibodies and of the bacterial DNA (nPCR). For this purpose, serum concentration of cortisol, dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S) and acute phase proteins (C reactive protein and haptoglobin) pre and post-stimulation with adrenocorticotropic hormone (ACTH) were assessed and compared to values obtained from healthy dogs (n=10). The results have shown similar cortisol response to the ACTH stimulation test between sick and healthy dogs. It suggests that dogs with ehrlichiosis of natural occurrence maintain the capacity of secreting cortisol properly before the ACTH stimulation. DHEA-S concentrations were significantly increased in sick dogs at pre and post-ACTH moments, in relation to healthy dogs, which illustrates the organic stress in the studied disease. Significant differences between both moments were not observed in the groups. Apparently, ACTH stimulation has not interfered in DHEA-S concentration, assessed one hour after its administration, suggesting that the response to the hormonal stimulation was not detected. The same way, ACTH stimulation has not interfered in the acute phase concentrations, although they were significantly increased in sick dogs, which reinforces the role of an inflammatory process in the course of the disease. The results indicate... (Complete abstract click electronic access below)

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2010. / Title from PDF title page (viewed on June 28, 2010). Includes bibliographical references (p.179-204).

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6106_DISSERTAÇÃO - MARA RÚBIA.pdf: 928755 bytes, checksum: ecd1f0d756f2f2262aa834ca9d8c7351 (MD5) Previous issue date: 2012-06-26 / Objetivou-se com este estudo determinar por meio da nested-PCR a prevalência da Ehrlichia canis em cães da região de Alegre-ES, e avaliar sua correlação com a presença de mórulas e trombocitopenia. Para isso, foram colhidas amostras sanguíneas de 85 cães, independente de raça, sexo, idade e estado de saúde. Com estas, foram confeccionadas lâminas para a pesquisa de mórulas, trombocitopenia, e execução da técnica de nested-PCR. Foi verificada uma prevalência de 1,17% ao pesquisar a presença de mórulas, 5,6% ao utilizar a técnica da nested-PCR, e foi verificada que 17,64% dos hemogramas apresentavam trombocitopenia. No entanto, somente 40% das amostras positivas pela nested-PCR, apresentaram trombocitopenia. Os resultados apresentados neste estudo demonstram que a introdução de técnicas de diagnóstico molecular como a nested-PCR é um método importante para o auxílio no diagnóstico precoce de patologias.

Orientador: Mirela Tinucci Costa / Banca: Marlos Gonçalves Sousa / Banca: Ricardo Duarte Silva / Resumo: A erliquiose em cães pode conduzir o animal ao óbito, tanto por alterações hematológicas quanto clínicas, que se explicam pelo caráter catabólico multifatorial da doença. O comprometimento adrenocortical pode ser esperado em virtude dos desafios impostos ao sistema imune, gerados pelas infecções e inflamações. Este estudo visou avaliar a ocorrência de alterações hormonais relacionadas às glândulas adrenais, em cães infectados naturalmente por Ehrlichia canis (n=21), positivos na identificação de anticorpos anti-E.canis (Dot-ELISA) e DNA da bactéria (nPCR). Para tanto, foram pesquisadas as concentrações séricas de cortisol, sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEA-S) e proteínas de fase aguda (proteína C reativa e haptoglobina) pré e pósestimulação com o hormônio adrenocorticotrópico (ACTH), e comparadas com os valores obtidos de cães saudáveis (n=10). Os resultados demonstraram resposta semelhante dos cães doentes e saudáveis ao teste de estimulação com ACTH, no que concerne ao cortisol. Isto sugere que cães com erliquiose de ocorrência natural mantêm a capacidade de secretar cortisol adequadamente diante o estímulo do ACTH. As concentrações de DHEA-S foram significativamente mais elevadas nos cães doentes, nos momentos pré e pós-ACTH, em relação aos saudáveis, o que ilustra o estresse do organismo na doença em estudo. Não foram observadas diferenças significativas entre os momentos dentro de cada grupo. Aparentemente, a estimulação com ACTH não interferiu na concentração de DHEA-S dosado uma hora após sua administração, sugerindo que a resposta ao estímulo hormonal não foi detectada. Da mesma forma, a estimulação com ACTH não interferiu na concentração das proteínas de fase aguda, embora se apresentassem significativamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ehrlichiosis in dogs may lead to death both for hematological and for clinical alterations that might be explained for its multifactorial catabolic character. The adrenocortical disruption may be expected during the course of the disease due to challenges on the immune system, generated by infection and inflammation. This study aimed to evaluate the occurrence of hormonal disturbances associated to the adrenal glands in dogs naturally infected by Ehrlichia canis (n=21), positive at the identification of anti-E. canis antibodies and of the bacterial DNA (nPCR). For this purpose, serum concentration of cortisol, dehydroepiandrosterone sulfate (DHEA-S) and acute phase proteins (C reactive protein and haptoglobin) pre and post-stimulation with adrenocorticotropic hormone (ACTH) were assessed and compared to values obtained from healthy dogs (n=10). The results have shown similar cortisol response to the ACTH stimulation test between sick and healthy dogs. It suggests that dogs with ehrlichiosis of natural occurrence maintain the capacity of secreting cortisol properly before the ACTH stimulation. DHEA-S concentrations were significantly increased in sick dogs at pre and post-ACTH moments, in relation to healthy dogs, which illustrates the organic stress in the studied disease. Significant differences between both moments were not observed in the groups. Apparently, ACTH stimulation has not interfered in DHEA-S concentration, assessed one hour after its administration, suggesting that the response to the hormonal stimulation was not detected. The same way, ACTH stimulation has not interfered in the acute phase concentrations, although they were significantly increased in sick dogs, which reinforces the role of an inflammatory process in the course of the disease. The results indicate... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.

O presente estudo visou obter informações sobre a epidemiologia da erliquiose canina no Brasil, a partir da caracterização molecular de isolados nacionais e de estudo de prevalência da infecção em cães (Canis familiaris) e carrapatos Rhipicephalus sanguineus. Inicialmente, padronizou-se o isolamento de Ehrlichia canis em cultivo de células DH82, a partir de um cão inoculado com a cepa Jaboticabal, seguida da identificação do isolado pelo sequenciamento de DNA de um fragmento do gene dsb de Ehrlichia. Posteriormente, realizou-se o isolamento de E. canis de um cão naturalmente infectado, atendido no Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Este novo isolado foi geneticamente caracterizado a partir da PCR almejando fragmentos dos genes dsb, 16S rRNA e P28. Com o estabelecimento do isolado Jaboticabal em cultivo celular, padronizou-se a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), utilizando-a em amostras de soros de 314 cães de áreas urbana e rural do Município de Monte Negro, RO. Finalmente, avaliou-se pela PCR do gene dsb, a freqüência de carrapatos infectados e de cães oriundos de quatro populações de R. sanguineus, uma do município de Monte Negro, RO. e três do estado de São Paulo. Do cão inoculado com o isolado Jaboticabal, constatou-se o crescimento de E. canis em cultivo celular, no 27o dia pós-inoculação, confirmado pela PCR e citologia. Após o seqüenciamento de DNA, o fragmento amplificado a partir do isolado apresentou-se 100% similar a seqüência correspondente ao gene dsb de E. canis depositada no GenBank. O isolamento de E. canis, a partir do cão atendido no HOVET, foi obtido no 14o dia pós-inoculação. Esta nova cepa, designada como isolado São Paulo, apresentou-se idêntica às seqüências do gene dsb e similares às seqüências dos genes 16S r RNA e P28, de outros isolados de E. canis disponíveis no GenBank. Dos soros testados pela RIFI, observou-se prevalência (títulos &plusmn; 40) de 31,2% (98/314), sendo 37,9% (58/153) em cães urbanos e 24,8% (40/161) em cães rurais (P < 0,05) de Monte Negro, Estado de Rondônia. A prevalência de carrapatos infectados (dada como freqüência mínima de infecção) foi de 2,3, 6,2, e 3,7% para as populações 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), e 3 (São Paulo I, SP), respectivamente (P > 0,05). Nenhum carrapato infectado foi detectado na população 4 (São Paulo II, SP). Os produtos da PCR dos carrapatos e de cães das populações 1, 2 e 3 foram idênticos entre si e à seqüência de E. canis disponível no GenBank. Estes resultados reforçam estudos anteriores, que relataram a infecção por E. canis em cães do Brasil, contudo descreve pela primeira vez no Brasil a infecção natural por E. canis em carrapatos R. sanguineus, tido como o principal carrapatos de cães no país. / The present study was conducted to investigate the canine ehrlichiosis epidemiology in Brazil, through molecular characterization of indigenous isolates and prevalence of infection in dogs (Canis familiaris) and Rhipicephalus sanguineus ticks. Firstly, it was performed the isolation of the Jaboticabal strain of Ehrlichia canis in DH82 cells from an experimentally infected dog, followed by molecular identification of the isolate by sequencing a fragment of the Ehrlichia dsb gene. After that, a new strain of E. canis was isolated from a naturally infected dog, assisted in the Veterinarian Hospital (HOVET) of the Faculty of Veterinary Medicine, University of São Paulo. This isolate was characterized by obtaining dsb, 16S rRNA and P28 nucleotide partial sequences. After the establishment of Jaboticabal strain in DH82 cells, an Indirect Immunofluorescence Test (IFAT) was developed, and 314 urban and rural dogs from Monte Negro Municipality were tested by this technique. Finally the prevalence of E. canis was determined in four different populations of Rhipicephalus sanguineus ticks, being one population from Monte Negro, RO. and three from different areas from São Paulo state using a PCR targeting an erlichial dsb gene fragment. Culture of E. canis Jaboticabal presented positive results by PCR on day 27. The dsb sequence was identical to other E. canis sequences available in GenBank. Cell culture inoculated with material from the dog assisted in the HOVET became positive by day 14 when dsb PCR was positive. This new strain was designated as isolate São Paulo of E. canis and showed to contain identical dsb and high similar partial sequences of 16S rRNA and P28 genes with others E. canis strains available in GenBank. Antibodies Anti-E. canis (titers &plusmn; 40) were detected in 31.2% (98/314) of the dogs, being 37.9% (58/153) in urban and 24.8% (40/161) in rural dogs of Monte Negro; these values were significantly different (P<0.05). The prevalence of infected ticks (given as minimal infection rate) was 2.3, 6.2, and 3.7% for populations 1 (Monte Negro), 2 (Jundiaí, SP), and 3 (São Paulo I, SP), respectively, which were statistically similar (P>0.05). In contrast, no infected tick was detected in population 4 (São Paulo II, SP). DNA sequences were determined for some of the PCR products generated from ticks and dogs from populations 1-3, being all identical to each other and to available sequences of E. canis. These results reinforce previous studies that reported E. canis infecting dogs in Brazil, but report for the first time in Brazil the natural infection of E. canis in its vector, R. sanguineus, which is the commonest tick infesting dog in this country.

Com o objetivo de avaliar o envolvimento da resposta imune humoral no desenvolvimento da anemia e das alterações quantitativas e qualitativas das plaquetas na erliquiose canina, sete cães adultos, livres de infecção, foram inoculados com E. canis e acompanhados durante 10 semanas. Três cães permaneceram como controles. Os animais foram submetidos a exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, contagem de plaquetas, mielograma, bioquímica sangüínea, fragilidade osmótica eritrocitária e teste de Coombs), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis, antiplaquetários e antimegacariocíticos (IFI), e teste da atividade de agregação plaquetária, em diferentes momentos durante o período de observação. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas da ALT, AST e FA foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre o 21&ordm; e 28&ordm; dias pós-infecção. Houve diminuição da capacidade de agregação plaquetária dos animais infectados (p<0,05) nos dias 14, 21, 28 e 35 pós-infecção e aumento do número das células megacariocíticas, principalmente seus precursores (megacarioblastos e pró-megacariócitos) no 14&ordm; dia pós-infecção. Não foram detectados anticorpos antiplaquetários ou antimegacariocíticos. O teste de Coombs, bem como a fragilidade osmótica eritrocitária, mantiveram-se inalterados, comprovando não ter ocorrido hemólise imunomediada. Conclui-se que a anemia desenvolvida durante a fase aguda da infecção experimental por E. canis, de característica eritroregenerativa, ainda que tardia, pelo menos nos animais estudados, não teve envolvimento de mecanismo imunológico direcionado contra as hemácias, e ainda, que a causa da trombocitopenia e da hipofunção plaquetária observada durante esta fase da doença não parece estar relacionada ao desenvolvimento de mecanismos imunológicos direcionados contra as plaquetas ou seus precursores. / In order to determine the involvement of humoral and immune response on development of anemia and quantitative and qualitative platelets disorders in experimental canine ehrlichiosis, seven adult naïve dogs were inoculated with E. canis and followed during 10 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, platelet counts, bone marrow evaluation, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test) polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E.canis, antiplatelet and antimegakaryocyte antibodies detection (IFA) and platelet aggregation studies were evaluated at different moments during all the experimental period. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver?s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial findings observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection. The infected animals showed a decrease in platelet aggregation responses (p<0.05) on days 14, 21, 28 and 35 post-infection and increase of megakaryocytic cells, mainly its precursors (megakaryoblasts and promegakaryocytes) on day 14 post-infection. It weren?t detected any antiplatelet or antimegakaryocyte antibodies, as well as, there were no variations on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? tests results, which confirms the absence of immune-mediated hemolysis. It is concluded that the anemia observed during the experimental acute phase of the E. canis infection, with regenerative pattern, even though late, at least in the studied animals, wasn?t related with immune mechanism against the red blood cells, and that, the thrombocytopenia and platelet dysfunction observed during this phase of the disease don?t seen to be related with immune mechanisms against platelets or its precursors.

Com o objetivo de avaliar o envolvimento da resposta imune humoral no desenvolvimento da anemia e das alterações quantitativas e qualitativas das plaquetas na erliquiose canina, sete cães adultos, livres de infecção, foram inoculados com E. canis e acompanhados durante 10 semanas. Três cães permaneceram como controles. Os animais foram submetidos a exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, contagem de plaquetas, mielograma, bioquímica sangüínea, fragilidade osmótica eritrocitária e teste de Coombs), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis, antiplaquetários e antimegacariocíticos (IFI), e teste da atividade de agregação plaquetária, em diferentes momentos durante o período de observação. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas da ALT, AST e FA foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre o 21&ordm; e 28&ordm; dias pós-infecção. Houve diminuição da capacidade de agregação plaquetária dos animais infectados (p<0,05) nos dias 14, 21, 28 e 35 pós-infecção e aumento do número das células megacariocíticas, principalmente seus precursores (megacarioblastos e pró-megacariócitos) no 14&ordm; dia pós-infecção. Não foram detectados anticorpos antiplaquetários ou antimegacariocíticos. O teste de Coombs, bem como a fragilidade osmótica eritrocitária, mantiveram-se inalterados, comprovando não ter ocorrido hemólise imunomediada. Conclui-se que a anemia desenvolvida durante a fase aguda da infecção experimental por E. canis, de característica eritroregenerativa, ainda que tardia, pelo menos nos animais estudados, não teve envolvimento de mecanismo imunológico direcionado contra as hemácias, e ainda, que a causa da trombocitopenia e da hipofunção plaquetária observada durante esta fase da doença não parece estar relacionada ao desenvolvimento de mecanismos imunológicos direcionados contra as plaquetas ou seus precursores. / In order to determine the involvement of humoral and immune response on development of anemia and quantitative and qualitative platelets disorders in experimental canine ehrlichiosis, seven adult naïve dogs were inoculated with E. canis and followed during 10 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, platelet counts, bone marrow evaluation, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test) polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E.canis, antiplatelet and antimegakaryocyte antibodies detection (IFA) and platelet aggregation studies were evaluated at different moments during all the experimental period. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver?s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial findings observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection. The infected animals showed a decrease in platelet aggregation responses (p<0.05) on days 14, 21, 28 and 35 post-infection and increase of megakaryocytic cells, mainly its precursors (megakaryoblasts and promegakaryocytes) on day 14 post-infection. It weren?t detected any antiplatelet or antimegakaryocyte antibodies, as well as, there were no variations on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? tests results, which confirms the absence of immune-mediated hemolysis. It is concluded that the anemia observed during the experimental acute phase of the E. canis infection, with regenerative pattern, even though late, at least in the studied animals, wasn?t related with immune mechanism against the red blood cells, and that, the thrombocytopenia and platelet dysfunction observed during this phase of the disease don?t seen to be related with immune mechanisms against platelets or its precursors.

Estudos filogenéticos recentes mostram que na América Latina há dois grupos distintos de carrapatos identificados como R. sanguineus. Carrapatos R. sanguineus da chamada América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) formam um grupo monofilético, claramente distinto de um segundo grupo monofilético, formado por R. sanguineus da denominada América Latina tropical (desde México ao estado Brasileiro de Santa Catarina), com claras possibilidades desses dois grupos estarem representados por duas espécies distintas dentro do complexo sanguineus. Estudos sobre erliquiose canina (causada por Ehrlichia canis) na América Latina indicam que E. canis é altamente prevalente em países da América Latina tropical, porém rara ou escassa na América Latina temperada. Desta forma, a hipótese primária do presente projeto foi que a ausência ou escassez de casos de erliquiose canina na América Latina temperada se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, em que os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial para E. canis. Baseado no exposto acima, o objetivo geral do presente projeto foi avaliar de forma comparativa a competência vetorial de quatro populações de R. sanguineus da região Neotropical, uma representando a América Latina tropical e três representando a América Latina temperada. Carrapatos nas fases de larvas e ninfas, derivados de quatro populações de R. sanguineus, provenientes da Argentina (América Latina temperada), Estado do Rio Grande do Sul (América Latina temperada), Uruguai (América Latina temperada) e da cidade de São Paulo, Brasil (América Latina tropical) foram expostos a E. canis, ao se alimentarem em cães infectados com E. canis, na fase aguda da doença. Em paralelo, larvas e ninfas não infectadas de cada uma das quatro populações foram levadas a infestar cães não infectados (grupo controle). As larvas e ninfas ingurgitadas, recuperadas nessa primeira fase, foram deixadas em estufa para realizarem ecdise para ninfas e adultos, respectivamente. Parte destas ninfas e adultos foi separada para análises moleculares. Outra parte dessas ninfas e adultos foi levada a infestar cães susceptíveis, a fim de se verificar a competência vetorial desses carrapatos das quatro populações. Nas infestações realizadas, amostras de sangue dos cães infestados foram colhidas semanalmente durante sessenta dias. Parte desse sangue foi processado imediatamente para hemograma, mostrando que somente os cães infestados com adultos de R. sanguineusde São Paulo, expostos a E. canis na fase de ninfa, apresentaram alterações marcantes de números de eritrócitos, volume globular, hemoglobina e plaquetas abaixo do valor mínimo de referência para cães sadios. Todos os demais cães infestados apresentaram valores de hemograma sem grandes alterações significativas. Nenhum cão apresentou febre. A outra parte do sangue colhido semanalmente foi separada para processamento por PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis e sorologia para pesquisa de anticorpos anti-E. canis. As análises moleculares (PCR em tempo real para pesquisa de DNA de E. canis) e sorológicas (imunofluorescência indireta) de todos esses cães foram realizadas, assim como as análises moleculares dos carrapatos, a fim de se verificar a freqüência de carrapatos de cada população que se infectou, após se alimentarem em cães infectados. Os resultados indicam que somente os carrapatos da colônia de São Paulo (América Latina tropical) foram competentes para transmitir a doençaa três cães sadios, que se mostraram positivos na PCR em tempo real e na soroconversão para E. canis. Todos os cães infestados com carrapatos das colônias da América Latina temperada (Chile, Argentina, Uruguai e estado do Rio Grande do Sul) não se infectaram por E. canis, mesmo que esses carrapatos haviam se alimentado, num estágio anterior, em um cão sabidamente infectado. Os testes moleculares dos carrapatos corroboram esses resultados, uma vez que nenhum carrapato adulto (exposto E. canis na fase de ninfa) das colônias da Argentina e Uruguai se mostrou positivo na PCR em tempo real, ao passo que pelo menos 1% das ninfas e 28% dos adultos de R. sanguineus da colônia São Paulo se mostraram positivos, após se alimentarem como larvas e ninfas, respectivamente, no mesmo cão infectado que serviu de alimento para os carrapatos da América Latina temperada (Uruguai, Argentina e Rio Grande do Sul). Em relação aos carrapatos provenientes do estado do Rio Grande do Sul, 4% dos adultos analisados logo após a ecdise se apresentaram positivos na PCR em tempo real, mas nenhum adulto foi positivo 30 dias após a ecdise. Como os carrapatos dessa população não foram competentes para transmitir a bactéria para cães susceptíveis, presume-se que os resultados positivos na PCR logo após a ecdise se deva a DNA residual da bactéria ingerida na alimentação da ninfa no cão infectado. Carrapatos adultos das quatro populações estudadas foram inoculados pela via intracelomática com emulsão de células DH82 infectadas com E. canis. Após ficarem incubados por 10 dias numa incubadora BOD a 25oC, se alimentaram por cinco dias em coelhos, quando então foram manualmente retirados e tiveram suas glândulas salivares dissecadas e submetidas a extração de DNA. Pela PCR em tempo real, somente 1 (10%) de 10 carrapatos da população de São Paulo foi positivo para E. canis, ao passo que nenhum carrapato das demais populações (10 carrapatos por população) foi positivo.Amostras de carrapatos adultos do grupo R .sanguineus coletados a campo em diferentes regiões do Brasil foram analisadas através da técnica de PCR em tempo real para verificar a presença da bactéria E. canis. Foram coletados R.sanguineus dos seguintes locais (30 a 374 carrapatos por localidade): São Paulo/SP, Cuiabá/MT, Campo Grande/MS, Paulo Afonso/BA, Cachoeira do Sul/RS, São Luís/MA, Uberlândia/MG, Bandeirantes/PR, Petrolina/PE, Ji-Paraná/RO; e amostras de Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina). Apenas os carrapatos de Cachoeria do Sul/RS, Campo Grande/MS, Montevidéu (Uruguai) e Rafaela (Argentina) foram todos negativos na PCR. Nas demais localidades, o percentual de carrapatos positivos para E. canis variou de 2,0 a 7.9%. Os resultados deste trabalho servem para uma melhor compreensão da ausência de casos de infecção canina por E. canis na América Latina temperada (cone sul) e reforçam a hipótese de que tal fato se deve à baixa competência vetorial dos carrapatos sob o táxon R. sanguineus presentes nessa região, ao contrário da América tropical, onde os carrapatos presentes sob o táxon R. sanguineus possuem alta competência vetorial. / Philogenetic studies have shown that in Latin America two different groups of the tick species Rhipicephalus sanguineus. These two groups found apart in two different regions, the Temperate region (Chile, Argentina, Uruguay and Southern Brazil) and the Tropical region (From Southern Brazil up to Mexico). It is likely that those two groups are represented by two different species within R. sanguineus group. Studies on ehrlichiosis (caused by Ehrlichiacanis) in the Latin America point thet E. canis is highly prevalent in the Tropical region whereas is rarely report in Temperate region. The present study tests the hypothesis that the distribution of ehrlichiosis are related to the low vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Temperate area and the high vectorial competence of the tick within the taxon group R. sanguineus found in the Tropical area. The objective of this study was to evaluate comparatively the vectorial competence of four R. sanguineus tick population, where three were collected in Temperate Area, from Argentina, Uruguay and State of Rio Grande do Sul (Brazil) and one from Tropical Area from the State of São Paulo (Brazil). Ticks from all four populations were exposed to E. canins through feeding upon infected dogs in acute disease phase, a control group were set up for each population by feeding larvae and nymphs on non infected dogs. All larvae and nymphs collected in this part of the study were allowed to molt in incubator (27oC,>85%RH) to nymphs and adults, respectively. Part of the ticks were selected to underwent molecular analysis, other part were released on susceptible dogs, in order to determine the vectorial competence for each of the tick populations. From the carried out infestations, samples of blood from the infested dogs were drawn weekly during 60 days. Part of the drawn blood was processed for hemogram that yielded that dogs infested with ticks from the São Paulo population, exposed to E. canis during the nymphal stage, showed important alteration on the number of erytrocytes, hemoglobine, packed cell volume, and platelets underneath the threshold for health dogs. All other dogs showed no important alteration in blood parameters. No fever was detected in any of the dogs. The other part of the weekly drawn blood from each dog was processed by real time PCR targeting E. canis DNA and processed by serology (Indirect immunofluorescence) seeking for anti-E. canis antibodies. Molecular analysis (real time PCR) on ticks were carried out in order to detect the prevalence of infected ticks on each population. Results show that only the ticks from the São Paulo population (Tropical Region) were competent in transmitting E. canis to three susceptible dogs, since material from these three fogs yielded positive in real time PCR and sorology tests. All dogs infested with ticks from the Argentina, Urugay and State of Rio Grande do Sul (Temperate Regions) population have not being infected by E. canis. The molecular tests on the ticks support this find since no tick from Argentina and Uruguay population yielded positive in the real time PCR, whereas about 1% of the nymphs and 28% of the adults of ticks from São Paulo population yielded positive in the real time PCR. The ticks from the State of Rio Grande do Sul population showed 4% of positive for real time PCR among the adult ticks tested, but when these ticks fed on susceptible dogs, they were not competent in transmitting the bacterium, what may shown that these PCR positive ticks might have residual bacterium DNA in the midgut. Analysis on the salivary gland from the adult ticks from all four tick populations that were either incoculates in vitro with E. canis or feeding upon infected dogs, showed positive for E. canis DNA only in the São Paulo population. Samples of ticks collected from different regions of Brazil were analyzed by real time PCR in order to detect E. canis bacterium DNA. There were collected R. sanguineus from the cities of São Paulo, Cuiabá, Campo Grande, Paulo Afonso, Cachoeira do Sul, São Luís, Uberlândia, Bandeirantes, Petrolina, Ji-Paraná; e amostras de Montevidéu (Uruguay) e Rafaela (Argentina). The State of Maranhão showed 7.94% of positive ticks, that being the highest prevalence found. Samples from State of Rio Grande do Sul, Campo Grande City, alongside with cities of Rafaela (Argentina) and Montevidéu (Uruguay), showed none positive tick for E. canins bacterium DNA. All presented data contribute for a better understanding on the absence of canine ehrlichiosis cases in the Temperate Latin America (Southern South America) and therefore support the hypothesis that this fact is related to the low vetorial competence of the ticks within the R. sanguineus taxon founded in this region, on the other hand, ticks within the R. sanguineus taxon found in Tropical Latin America show high vectorial competence in E. canis transmission.