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Previous issue date: 2011-11-07 / In equine, the intersections between reproduction and genomics are numerous, however, little known about the genetic factors that acting on fertility. The conclusion
of equine genome sequencing project, brings the oportunity to evaluate candidate genes and molecular biomarkers for specific reproductive characteristics. Based on this information, this PhD thesis aimed to develop genomic studies applied to equine
reproduction. The first paper analyzed the expression of apoptotic-related genes (Bax, Bcl-2, survivin and p53) in equine cumulus-oocyte complex by qRT-PCR, comparing gene expression between morphologically distinct oocytes and cumulus cells during in vitro maturation. Results showed that survivin mRNA levels were higher (P<0.05) and p53 mRNA levels was lower (P<0.01) in oocytes compared to cumulus cells in morphologically healthy. On the other hand, expression of the Bax was significantly higher in morphologically healthy cumulus cells (P<0.02). The second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene, looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene. The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion (P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The
second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene, looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene. The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion (P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The
third article has determined the presence of circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) in pregnant mare s plasma, looking to develop a molecular test for the prenatal diagnosis of fetal sex determination using SRY gene amplification by PCR, reamplification by PCR (2nd-PCR) and real-time quantitative PCR (qPCR). This is the first report of ccffDNA in equine species. The molecular sexing test resulted in sensitivity of 72% and accuracy of 85% on the PCR. Using the 2nd-PCR and qPCR we obtained an increasing in the sexing sensitivity results (90.9%) and an accuracy of 95%. This study demonstrates for the first time the fetal sex determination in
mares using ccffDNA. This PhD thesis resulted in the publication of three papers in international journals of reproduction and a patent application request. The results
presented here collaborate to understand the equine reproductive biology, and indicate potential genetic markers to fertility parameters. / Em equinos, as intersecções entre a reprodução e a genômica são numerosas, no entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que atuam na fertilidade. Com o genoma equino completo, existe a possibilidade de análises moleculares e estudo de genes candidatos a biomarcadores para características reprodutivas específicas. Com base nestas informações, a presente tese teve como objetivo desenvolver
estudos de genômica aplicada à reprodução equina. O primeiro artigo analisou a expressão de genes relacionados a apoptose (Bax, Bcl-2, survivin e p53) no complexo cumulus oócito equino através de qRT-PCR, comparando a expressão gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características
morfológicas durante a maturação in vitro. Como resultados, foi observada maior expressão do survivin (P<0.05) e menor expressão de p53 (P<0.01) em oócitos comparado a células do cumulus do grupo considerado morfologicamente saudável.
Enquanto que a expressão de Bax foi maior (P<0.02) em células do cumulus do grupo saudável comparado ao grupo com características morfológicas não desejáveis. O segundo artigo analisou um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)
no gene p53, relacionando-o a parâmetros reprodutivos de éguas Puro Sangue
Inglês. Foi relatado pela primeira vez um SNP Arginina/Prolina na região do exon 4 do gene p53 equino. A prevalência foi de 73,3% para o genótipo heterozigoto, 17,1% do genótipo Arginina/Arginina e 9,6% do Prolina/Prolina. O genótipo Arginina/Prolina foi associado (P=0.02) a ocorrência de aborto, enquanto que o genótipo Prolina/Prolina foi associado (P<0.05) a menor probabilidade de aborto, indicando um papel da p53 na reprodução equina. O terceiro artigo determinou a presença de
DNA fetal livre e circulante (ccffDNA) no plasma de éguas prenhas, desenvolvendo um teste molecular de diagnóstico pré-natal na determinação do sexo fetal através da amplificação do gene SRY pelas técnicas de PCR, de re-amplificação por PCR (2º-PCR) e de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Este é o primeiro relato do DNA fetal livre e circulante em equinos. O teste de sexagem molecular resultou em 72% de sensibilidade e 85% de acurácia na técnica de PCR. Com o 2º-PCR e qPCR a sensibilidade foi de 90,9% e 95% de acurácia. Este estudo demonstra pela primeira vez a determinação do sexo fetal em éguas utilizando o ccffDNA. Os
resultados apresentados colaboram para o entendimento da biologia reprodutiva da espécie equina, e indicam marcadores genéticos em potencial para parâmetros de fertilidade. Esta tese resultou na publicação de três artigos em periódicos
internacionais da área de Reprodução e um pedido de Patente de Invenção.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1221 |
| Date | 07 November 2011 |
| Creators | Leon, Priscila Marques Moura de |
| Contributors | CPF:92045715000, Collares, Tiago Veiras |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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