Septinas fazem parte de uma família de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanina e já foram encontradas em diversos eucariontes, mas nunca em plantas. Essas proteínas têm sido descritas como atuantes na citocinese, estruturação celular e exocitose, mas pouco se conhece do seu modo de ação. Além disso, as septinas mostraram-se capazes de se polimerizar em heterofilamentos altamente organizados, a partir da interação com outras septinas, mas as referências à existência e funcionalidade de homofilamentos de septinas permanecem escassas e controversas. Este trabalho visou caracterizar a função da septina da alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii, um eucarionte modelo que divergiu há muito de um ancestral comum a plantas e metazoários, e que possui uma única septina, diferente dos demais eucariontes estudados até o momento. Para tal, foram realizados ensaios de duplo híbrido para detecção de possíveis proteínas parceiras à septina de C. reinhardtii, além de análise de expressão gênica em diferentes pontos do ciclo celular por PCR quantitativo (qPCR), silenciamento gênico por micro-RNA artificial de interferência e imunolocalização por microscopia confocal. Os ensaios de duplo híbrido retornaram duas possíveis proteínas parceiras de interação à septina de Chalmydomonas reinhardtii (CrSept) – S-Adenosyl-Homocysteine-Hydrolase (CrSAHH) e Subtilase-like-Serino-Protease (esporangina) – ambas relacionada à estrutura flagelar. A interação entre CrSept e CrSAHH não foi validada através das técnicas de pulldown e crosslinking, porém, os experimentos de imunolocalização da proteína in situ mostraram uma grande concentração de CrSept na base flagelar durante as fases G0, e G1, com mudança no perfil de localização para o citoplasma durante as fases S e M do ciclo celular, evidenciando uma participação da septina na estrutura flagelar e não excluindo a possibilidade de uma interação in vivo entre CrSept e CrSAHH. Análises do nível de expressão gênica de CrSept mostraram uma tendência de maior expressão do gene da septina durante o período claro, com redução na fase escura do ciclo celular, resultados que se assemelham aos observados pela análise qualitativa, por western blot, da expressão da proteína ao longo do ciclo celular. Os experimentos de silenciamento gênico, por fim, mostraram um possível fenótipo relacionado à redução de mRNA de CrSept, não observado no grupo controle. Estes resultados mostram que a CrSept possui caráter estrutural na alga verde C. reinhardtii, podendo atuar como suporte para outras proteínas durante a fase de crescimento celular. Além disso, localizações pontuais por toda a célula durante a fase de divisão celular sugerem que a CrSept desempenha um importante papel na manutenção da estrutura celular para a conclusão da divisão celular. / Septins belong to a family of proteins that bind guanine nucleotide and have been found in many eukaryotes, but never in plants. These proteins have been described in cytokinesis process, cell structure and exocytosis, but little is known about their way of action. Besides, septins are capable of polymerize in high organized heterofilaments when interacting with other septins, but references and functional studies of septins homofilaments remain controversial. This work aimed to characterize the function of the unique septin from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, a model eukaryote organism that long diverged from a common ancestor to plants and Metazoans and that has a single septin. For that, yeast two-hybrid assays were conducted in search of possible partner proteins to C.reinhardtii, septin (CrSept); also, gene expression analyses by qPCR of different points of the cell cycle helped characterize the expression profile of the CrSept gene and gene silencing by artificial micro-RNA (amiRNA) and immunolocalization by confocal microscopy were used to enrich functional and localization studies. The yeast two-hybrid assays returned two possible partner proteins to CrSept - S-Adenosyl-Homocysteine-Hydrolase (CrSAHH) e Subtilase-like-Serino-Protease (sporangin) – both related to the flagella structure. The interaction among CrSept and CrSAHH could not be validated in vitro by pulldown or crosslink assays, however, the in situ immunostaining showed CrSept can mostly be found in punctual concentrated spots close to the base of the flagella during G0 and G1 phases of the cell cycle, which differs from the profile observed during phases S and M, where the protein can be observed as punctual spots through the whole cell. These results strengths CrSept role on the flagellar structure and do not exclude the possibility of an in vivo interaction between CrSept and CrSAHH. Gene expression analyses showed that septin is mostly expressed during the light part of the cycle, which is also observed at the protein quantitative analysis by western blot. Gene silencing experiments showed a possible phenotype in clones expressing amiRNA against CrSept, which was not observed on control group. Together, these results suggest CrSept has a structural role in C. reinhardtii and might work as a scaffold to other proteins during cell growth stage. Besides, punctual staining observed during mitosis suggests CrSept might help maintaining cell structure until cell division is completed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-11092017-084455 |
| Date | 03 May 2017 |
| Creators | Heloísa Ciol |
| Contributors | Ana Paula Ulian de Araujo, Maria Celia Bertolini, Júlio César Borges, Richard Charles Garratt, Jeferson Gross |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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