Die Angiogenese ist entscheidend an wichtigen physiologischen Prozessen wie Wachstum, Reproduktion oder Heilung beteiligt. Jedoch spielt sie auch bei der Pathogenese spezifischer Erkrankungen eine wichtige Rolle. Bis jetzt ist der komplexe Mechanismus der physiologischen Angiogenese nur unzureichend verstanden. So wird angenommen, dass humane Endothelzellen über eine autokrine cholinerge Regulation Angiogenese physiologisch beeinflussen und dass dies Teil des non-neuronalen cholinergen Systems ist.
Sind humane Endothelzellen in der Lage Acetylcholin zu produzieren? Beeinflusst dieser endogene Ligand über cholinerge Rezeptoren physiologisch Angiogenese und ist dies Teil des non-neuronalen cholinergen Systems?
Dazu wurden humane Endothelzellen aus Nabelschnurvenen (HUVEC) für 5 Tage bis zu einer 80%igen Konfluenz kultiviert und anschließend auf ein in vitro Angiogenesis Assay (Matrigel) aufgebracht. Nach ca. 18 h Inkubation konnte die Ausbildung eines Kapillarnetzwerkes beobachtet werden, welches mittels festem Schema bewertet wurde. Während der gesamten Inkubation erfolgte entweder die Hemmung der Acetylcholinesterase mittels Eserin-Hemisulfat zur Steigerung der Acetylcholinkonzentration oder die Blockierung des Re-Uptakes des Cholins zur Senkung der Acetylcholinkonzentration mittels Hemicholinium-3. Zur Untersuchung der verschiedenen Rezeptoren erfolgte stets die Stimulation mit Eserin-Hemisulfat sowie abhängig davon welche Rezeptoren untersucht werden sollten, die Hemmung der muscarinergen Acetylcholinrezeptoren (mAChR) durch Atropin oder die Hemmung der nicotinergen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) durch Mecamylamin. Zur Sub-Spezifizierung der nACh-Rezeptoren erfolgte jeweils die Zugabe von Eserin-Hemisulfat zur Steigerung der Acetylcholinkonzentration, von Atropin zur Blockierung der muscarinergen Acetylcholinrezeptoren und zur Blockierung der jeweiligen Sub-Typen des nicotinergen Acetylcholinrezeptors, entweder α-Bungarotoxin (Blockierung α7-Untereinheit), Lobelin-Hydrochlorid (Blockierung α4/β2-Untereinheit) oder Dihydro-β-Erythroidin (Blockierung α3/β2-Untereinheit und α4/β2-Untereinheit). Zur Quantifizierung der Acetylcholinkonzentration aus dem Zellüberstand kam ein kolorimetrisches Nachweisverfahren zur Anwendung. Des Weiteren wurde eine immunhistologische Färbung zum Nachweis der Cholin-Acetyltransferase (ChAT) durchgeführt.
Durch Hemmung der Acetylcholinesterase mittels Eserin-Hemisulfat konnte mittels kolorimetrischem Nachweisverfahren eine signifikant erhöhte Acetylcholinkonzentration im Zellüberstand beobachtet werden. Des Weiteren wurde mittels immunhistologischer Färbung das Enzym Cholin-Acetyltransferase (ChAT) nachgewiesen.
Bei Blockierung der verschiedenen Rezeptoren bei gleichzeitig gesteigerter Acetylcholinkonzentration fiel bei der Hemmung der nAChR und Stimulation über die mAChR eine signifikant gesteigerte Komplexität des Kapillarnetzwerks, eine gesteigerte Kapillarlänge sowie eine gesteigerte Zellzahl auf. Dies zeigte sich bei der Wirkung nur über die nicotinergen Acetylcholinrezeptoren (nAChR) umgekehrt. Eine Hemmung der mAChR sowie α3/β2- und α4/β2-Subtypen des nAChR durch Dihydro-β-Erythroidin bei bevorzugter Stimulation über den α7-Subtyp führte zu einer gesteigerten Kapillarlänge. Wurde der α7-Subtyp des nAChR jedoch durch α-Bungarotoxin blockiert, führte dies nicht zu einer verkürzten Kapillarlänge. Bei der Blockierung des α4/β2-Subtyp des nAChR durch Lobelin-Hydrochlorid ließ sich nahezu kein Effekt auf die endotheliale Angiogenese beobachten.
Schlussfolgerung: Insgesamt darf aus diesen Ergebnissen geschlossen werden, dass humane Endothelzellen Acetylcholin produzieren und über die entsprechenden Enzyme zur Herstellung und zum Abbau des Transmitters verfügen. Sie beeinflussen über diesen endogenen Liganden mittels cholinerger Rezeptoren die Angiogenese. Der Effekt scheint sich bei Stimulation aller cholinerger Rezeptoren auszugleichen.
Werden nur die mAChR mittels Acetylcholin stimuliert hat dies eine gesteigerte Kapillarlänge, eine gesteigerte Komplexität des Kapillarnetzwerkes sowie eine gesteigerte Zellzahl zur Folge. Bei Stimulation aller nAChRs und Blockierung der mAChRs, zeigt sich insgesamt eine geringere Kapillarlänge mit weniger Abzweigungen. Abhängig vom Subtyp der nAChR bildet sich eine geringere Komplexität des Kapillarnetzwerks mit weniger Abzweigungen bei teilweiser gesteigerter oder geringerer Kapillarlänge aus. Wird der α7-Subtyp des nAChR blockiert, bildeten sich signifikant längere Kapillaren mit signifikant weniger Abzweigungen. Insgesamt ist dieser autokrine Mechanismus des Acetylcholins an den cholinergen Rezeptoren Teil des non-neuronalen cholinergen Systems:Inhaltsverzeichnis I
Abbildungsverzeichnis III
Tabellenverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis V
1 Einleitung 1
1.1 Angiogenese 2
1.2 Endothelzellen 4
1.3 Das non-neuronale cholinerge System 6
1.3.1 Acetylcholin 9
1.3.2 Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 10
1.3.3 Acetylcholinesterase 11
1.4 Die cholinergen Rezeptoren 12
1.4.1 Der muscarinerge Acetylcholin-Rezeptor (mAChR) 12
1.4.2 Der nicotinerge Acetylcholinrezeptor (nAChR) 13
1.5 Fragestellung 14
2 Materialliste 16
2.1 Chemikalien 16
2.2 Allgemeine Geräte 17
2.3 Präparierbesteck 20
2.4 Zellkultur 20
2.5 Zellzahlbestimmung 21
2.6 Behandlung der Zellen 22
2.7 In vitro Angiogenesis Assay, Matrigel (3D-Zellkultur) 22
2.8 Immunhistologie Cholin-Acetyltransferase 23
2.9 Acetylcholine Quantification Assay 24
2.10 Software 24
3 Methoden 25
3.1 Gewinnung humaner Endothelzellen aus Nabelschnüren 25
3.2 Behandlung der Zellen 27
3.3 In vitro Angiogenesis Assay, Matrigel (3D-Zellkultur) 29
3.4 Fluoreszenzmikroskopie 31
3.5 Auswertung Fluoreszenzaufnahmen 31
3.6 Immunhistologie Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 32
3.7 Acetylcholine Quantification Assay 34
3.8 Statistische Auswertung 35
4 Ergebnisse 36
4.1 Quantitativer Nachweis von Acetylcholin 36
4.2 Immunhistologischer Nachweis der Cholin-Acetyltransferase (ChAT) 38
4.3 Effekt von Acetylcholin auf die endotheliale Angiogenese 38
5 Diskussion 49
6 Zusammenfassung 56
7 Literaturverzeichnis VII
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit XVII
Lebenslauf XVIII
Publikationen im Zusammenhang mit dieser Arbeit XXII
Danksagung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:31795 |
| Date | 26 September 2018 |
| Creators | Wermke, Alice Regina |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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