La chromatine est plus qu’un système d’empaquetage de l’ADN ; elle est le support de toutes les réactions liées à l’ADN dans le noyau des cellules eucaryotes et participe au contrôle de l’accès de l’ARN polymérase II (ARNPolII) à l’ADN. Responsable de la transcription de tous les ARNm des cellules eucaryotes, l’ARNPolII doit, suivant son recrutement aux promoteurs des gènes, transcrire l’ADN en traversant la matrice chromatinienne. Grâce au domaine C-terminal (CTD) de sa sous-unité Rpb1, elle coordonne la maturation de l’ARNm en cours de synthèse ainsi que les modifications de la chromatine, concomitantes à la transcription. Cette thèse s’intéresse à deux aspects de la transcription : la matrice, avec la localisation de la variante d’histone H2A.Z, et la machinerie de transcription avec le cycle de phosphorylation du CTD de l’ARNPolII.
Suivant l’introduction, le chapitre 2 de cette thèse constitue un protocole détaillé et annoté de la technique de ChIP-chip, chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette technique phare dans l’étude in vivo des phénomènes liés à l’ADN a grandement facilité l’étude du rôle de la chromatine dans les phénomènes nucléaires, en permettant de localiser sur le génome les marques et les variantes d’histones. Ce chapitre souligne l’importance de contrôles adéquats, spécifiques à l’étude de la chromatine.
Au chapitre 3, grâce à la méthode de ChIP-chip, la variante d’histone H2A.Z est cartographiée au génome de la levure Saccharomyces cerevisiae avec une résolution d’environ 300 paires de bases. Nos résultats montrent que H2A.Z orne un à deux nucléosomes au promoteur de la majorité des gènes. L’enrichissement de H2A.Z est anticorrélé à la transcription et nos résultats suggèrent qu’elle prépare la chromatine pour l’activation des gènes. De plus H2A.Z semble réguler la localisation des nucléosomes.
Le chapitre suivant s’intéresse à la transcription sous l’angle de la machinerie de transcription en se focalisant sur le cycle de phosphorylation de l’ARN polymérase II. Le domaine C-terminal de sa plus large sous-unité est formé de répétitions d’un heptapeptide YSPTSPS dont les résidus peuvent être modifiés au cours de la transcription. Cette étude localise les marques de phosphorylation des trois résidus sérine de manière systématique dans des souches mutantes des kinases et phosphatases. Nos travaux confirment le profil universel des marques de phosphorylations aux gènes transcrits. Appuyés par des essais in vitro, ils révèlent l’interaction complexe des enzymes impliqués dans la phosphorylation, et identifient Ssu72 comme la phosphatase de la sérine 7. Cet article appuie également la notion de « variantes » des marques de phosphorylation bien que leur étude spécifique s’avère encore difficile.
La discussion fait le point sur les travaux qui ont suivi ces articles, et sur les expériences excitantes en cours dans notre laboratoire. / Chromatin is more than just the eucaryotic DNA packaging system; it is the substrate of all reactions involving DNA in eukaryotic cells and actively regulates RNA Polymerase II (RNAPolII) access to DNA. Responsible for all mRNA transcription in eucaryotes, the RNAPolII must, following its recruitment to the pre-initiation complex, overcome the chromatin barrier in order to transcribe genes. The RNAPolII CTD allows for the co-transcriptional coordination of mRNA maturation and chromatin modifications. The work covered in this thesis addresses two aspects of transcription: the chromatin substrate, with the localization of H2A variant, H2A.Z, and the transcription complex with the phosphorylation cycle of the RNAPolII CTD.
Following the introduction, chapter 2 constitutes a detailed and annotated Saccharomyces cerevisiae ChIP-chip protocol, from the culture to the hybridization of the array, with an emphasis on the proper controls required for chromatin study. This technique, extremely powerful for the in vivo study of all DNA transactions, leads to a better understanding of chromatin function in nuclear phenomena, thanks to the localization of histone variants and modifications.
The third chapter maps the H2A.Z variant across the yeast genome at ~300 base pairs resolution using ChIP-chip. Our data shows that H2A.Z is incorporated into one or two promoter-bound nucleosomes at the majority of genes. H2A.Z enrichment is anticorrelated with transcription, and the results suggest that it configures chromatin structure to poise genes for transcriptional activation. Furthermore, we have shown that H2A.Z can regulate nucleosome positioning.
The next chapter focuses on the transcription machinery and, more precisely, on the phosphorylation cycle of RNAPolII. The CTD contains repetitions of a heptapeptide (YSPTSPS) on which all serines are differentially phosphorylated along genes in a prescribed pattern during the transcription cycle. Here, we systematically profiled the location of the RNAPII phospho-isoforms in wild-type cells and mutants for most CTD modifying enzymes. The results provide evidence for a uniform CTD cycle across genes. Together with results from in vitro assays, these data reveal a complex interplay between the modifying enzymes, identify Ssu72 as the Ser7 phosphatase and show that proline isomerization is a key regulator of CTD dephosphorylation at the end of genes. Moreover, it reinforces the notion of variants of the phosphorylation marks, even though the exact nature of the variant is still difficult to identify.
The discussion introduces the studies that followed this work, including new projects conceived in our lab.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMU.1866/8735 |
| Date | 02 1900 |
| Creators | Bataille, Alain R. |
| Contributors | Robert, François |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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