A cinomose canina, causada pelo vírus Canine Distemper (CDV), é uma doença de grande importância não só no Brasil como no mundo. Isto se deve principalmente à sua vasta ocorrência, facilitada pelo tipo de transmissão que pode ser por contato com secreções respiratórias, oculares, por fezes e urina. Detectar rapidamente o vírus em animais contaminados é de extrema importância para que o controle aconteça de forma rápida e adequada, evitando o agravamento da doença, a disseminação e o aumento da mortalidade. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver uma plataforma diagnóstica imunocromatográfica que possibilite a detecção rápida de biomoléculas relacionadas com esta doença. Os testes imunocromatográficos são por natureza plataformas de baixo custo e que fornecem resultados rápidos sem a necessidade de equipamentos para a interpretação. Essas plataformas são compostas por regiões diferentes de papéis ou membranas, constituídos de fibra de vidro (sample pad e conjugate pad), material celulósico (sample pad e absorbent pad) e nitrocelulose (região de detecção). Nesse trabalho, com o intuído de diminuir ainda mais o custo da plataforma, foi avaliada a possibilidade de substituição das diferentes regiões somente pelo do papel de filtro Whatman nº 1. Para isso, foi necessário a otimização de diversos reagentes e tratamentos que fossem capazes de modificar a estrutura do papel, deixando-o mais reativo frente às proteínas imobilizadas na região de detecção, como o periodato de sódio, divinilsulfona e tampão carbonato; e menos reativos, quando utilizado em outras regiões. Antes de iniciar os ensaios com o papel, os anticorpos foram avaliados por immunoblotting para verificar o funcionamento dos mesmos, em relação à sensibilidade e especificidade. Após a avaliação, os anticorpos foram imobilizados com sucesso no papel de filtro através do uso de tampão carbonado como reagente sensibilizador da celulose, levando à construção das regiões teste e controle. No conjugate pad o tratamento mais eficiente foi com a utilização de 5% de sacarose, 1% de BSA e 0,5% de Tween-20 em PBS, que garantiu a liberação satisfatória dos conjugados para a região de detecção. / Canine distemper, caused by the Canine Distemper virus (CDV), is a disease of great importance not only in Brazil, but also in the world. This is due mainly to its vast occurrence, facilitated by the transmission pathways, which may occur through contact with respiratory and/or ocular secretions, feces and urine. Rapid detection of the virus in contaminated animals is extremely important so that control takes place quickly and properly, avoiding disease worsening, its dissemination and mortality increase. The present work aimed in developing an immunochromatographic diagnostic platform that allows rapid detection of biomolecules related to this disease. Immunochromatographic tests are naturally low-cost platforms that provide fast results without need for equipment for interpretation. These platforms are composed by different regions of paper or glass fiber membranes (sample pad and conjugate pad), cellulosic material (sample pad and absorbent pad), and nitrocellulose (detection region). In this work, with the intention of further platform\'s cost reduction, the possibility of replacing the different regions was evaluated by using only the Whatman nº 1 filter paper. For this, it was necessary to optimize several reagents and treatments that were capable of modifying the paper structure, making it more reactive to the proteins immobilized in the detection region, such as sodium periodate, divinylsulfone, and carbonate buffer; and less reactive paper when used in other regions. Before initiating the paper assays, the antibodies were evaluated by immunoblotting for verifying their function, regarding sensitivity and specificity. With the results obtained within this test, new strategies had and have been drawn and will be followed in future experiments. After the evaluation, the antibodies were successfully immobilized on the filter paper with the use of carbonate buffer as the cellulose sensitizer reagent, leading to the construction of the test and control regions. In the conjugate pad the most efficient treatment was the use of 5% sucrose, 1% BSA and 0.5% Tween-20 in PBS, which ensured the satisfactory release of the conjugates to the detection region.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14062017-101449 |
| Date | 24 March 2017 |
| Creators | Postigo, Julia Pereira |
| Contributors | Carrilho, Emanuel |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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