A cinomose canina, causada pelo vírus Canine Distemper (CDV), é uma doença de grande importância não só no Brasil como no mundo. Isto se deve principalmente à sua vasta ocorrência, facilitada pelo tipo de transmissão que pode ser por contato com secreções respiratórias, oculares, por fezes e urina. Detectar rapidamente o vírus em animais contaminados é de extrema importância para que o controle aconteça de forma rápida e adequada, evitando o agravamento da doença, a disseminação e o aumento da mortalidade. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver uma plataforma diagnóstica imunocromatográfica que possibilite a detecção rápida de biomoléculas relacionadas com esta doença. Os testes imunocromatográficos são por natureza plataformas de baixo custo e que fornecem resultados rápidos sem a necessidade de equipamentos para a interpretação. Essas plataformas são compostas por regiões diferentes de papéis ou membranas, constituídos de fibra de vidro (sample pad e conjugate pad), material celulósico (sample pad e absorbent pad) e nitrocelulose (região de detecção). Nesse trabalho, com o intuído de diminuir ainda mais o custo da plataforma, foi avaliada a possibilidade de substituição das diferentes regiões somente pelo do papel de filtro Whatman nº 1. Para isso, foi necessário a otimização de diversos reagentes e tratamentos que fossem capazes de modificar a estrutura do papel, deixando-o mais reativo frente às proteínas imobilizadas na região de detecção, como o periodato de sódio, divinilsulfona e tampão carbonato; e menos reativos, quando utilizado em outras regiões. Antes de iniciar os ensaios com o papel, os anticorpos foram avaliados por immunoblotting para verificar o funcionamento dos mesmos, em relação à sensibilidade e especificidade. Após a avaliação, os anticorpos foram imobilizados com sucesso no papel de filtro através do uso de tampão carbonado como reagente sensibilizador da celulose, levando à construção das regiões teste e controle. No conjugate pad o tratamento mais eficiente foi com a utilização de 5% de sacarose, 1% de BSA e 0,5% de Tween-20 em PBS, que garantiu a liberação satisfatória dos conjugados para a região de detecção. / Canine distemper, caused by the Canine Distemper virus (CDV), is a disease of great importance not only in Brazil, but also in the world. This is due mainly to its vast occurrence, facilitated by the transmission pathways, which may occur through contact with respiratory and/or ocular secretions, feces and urine. Rapid detection of the virus in contaminated animals is extremely important so that control takes place quickly and properly, avoiding disease worsening, its dissemination and mortality increase. The present work aimed in developing an immunochromatographic diagnostic platform that allows rapid detection of biomolecules related to this disease. Immunochromatographic tests are naturally low-cost platforms that provide fast results without need for equipment for interpretation. These platforms are composed by different regions of paper or glass fiber membranes (sample pad and conjugate pad), cellulosic material (sample pad and absorbent pad), and nitrocellulose (detection region). In this work, with the intention of further platform\'s cost reduction, the possibility of replacing the different regions was evaluated by using only the Whatman nº 1 filter paper. For this, it was necessary to optimize several reagents and treatments that were capable of modifying the paper structure, making it more reactive to the proteins immobilized in the detection region, such as sodium periodate, divinylsulfone, and carbonate buffer; and less reactive paper when used in other regions. Before initiating the paper assays, the antibodies were evaluated by immunoblotting for verifying their function, regarding sensitivity and specificity. With the results obtained within this test, new strategies had and have been drawn and will be followed in future experiments. After the evaluation, the antibodies were successfully immobilized on the filter paper with the use of carbonate buffer as the cellulose sensitizer reagent, leading to the construction of the test and control regions. In the conjugate pad the most efficient treatment was the use of 5% sucrose, 1% BSA and 0.5% Tween-20 in PBS, which ensured the satisfactory release of the conjugates to the detection region.

A cinomose canina, causada pelo vírus Canine Distemper (CDV), é uma doença de grande importância não só no Brasil como no mundo. Isto se deve principalmente à sua vasta ocorrência, facilitada pelo tipo de transmissão que pode ser por contato com secreções respiratórias, oculares, por fezes e urina. Detectar rapidamente o vírus em animais contaminados é de extrema importância para que o controle aconteça de forma rápida e adequada, evitando o agravamento da doença, a disseminação e o aumento da mortalidade. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver uma plataforma diagnóstica imunocromatográfica que possibilite a detecção rápida de biomoléculas relacionadas com esta doença. Os testes imunocromatográficos são por natureza plataformas de baixo custo e que fornecem resultados rápidos sem a necessidade de equipamentos para a interpretação. Essas plataformas são compostas por regiões diferentes de papéis ou membranas, constituídos de fibra de vidro (sample pad e conjugate pad), material celulósico (sample pad e absorbent pad) e nitrocelulose (região de detecção). Nesse trabalho, com o intuído de diminuir ainda mais o custo da plataforma, foi avaliada a possibilidade de substituição das diferentes regiões somente pelo do papel de filtro Whatman nº 1. Para isso, foi necessário a otimização de diversos reagentes e tratamentos que fossem capazes de modificar a estrutura do papel, deixando-o mais reativo frente às proteínas imobilizadas na região de detecção, como o periodato de sódio, divinilsulfona e tampão carbonato; e menos reativos, quando utilizado em outras regiões. Antes de iniciar os ensaios com o papel, os anticorpos foram avaliados por immunoblotting para verificar o funcionamento dos mesmos, em relação à sensibilidade e especificidade. Após a avaliação, os anticorpos foram imobilizados com sucesso no papel de filtro através do uso de tampão carbonado como reagente sensibilizador da celulose, levando à construção das regiões teste e controle. No conjugate pad o tratamento mais eficiente foi com a utilização de 5% de sacarose, 1% de BSA e 0,5% de Tween-20 em PBS, que garantiu a liberação satisfatória dos conjugados para a região de detecção. / Canine distemper, caused by the Canine Distemper virus (CDV), is a disease of great importance not only in Brazil, but also in the world. This is due mainly to its vast occurrence, facilitated by the transmission pathways, which may occur through contact with respiratory and/or ocular secretions, feces and urine. Rapid detection of the virus in contaminated animals is extremely important so that control takes place quickly and properly, avoiding disease worsening, its dissemination and mortality increase. The present work aimed in developing an immunochromatographic diagnostic platform that allows rapid detection of biomolecules related to this disease. Immunochromatographic tests are naturally low-cost platforms that provide fast results without need for equipment for interpretation. These platforms are composed by different regions of paper or glass fiber membranes (sample pad and conjugate pad), cellulosic material (sample pad and absorbent pad), and nitrocellulose (detection region). In this work, with the intention of further platform\'s cost reduction, the possibility of replacing the different regions was evaluated by using only the Whatman nº 1 filter paper. For this, it was necessary to optimize several reagents and treatments that were capable of modifying the paper structure, making it more reactive to the proteins immobilized in the detection region, such as sodium periodate, divinylsulfone, and carbonate buffer; and less reactive paper when used in other regions. Before initiating the paper assays, the antibodies were evaluated by immunoblotting for verifying their function, regarding sensitivity and specificity. With the results obtained within this test, new strategies had and have been drawn and will be followed in future experiments. After the evaluation, the antibodies were successfully immobilized on the filter paper with the use of carbonate buffer as the cellulose sensitizer reagent, leading to the construction of the test and control regions. In the conjugate pad the most efficient treatment was the use of 5% sucrose, 1% BSA and 0.5% Tween-20 in PBS, which ensured the satisfactory release of the conjugates to the detection region.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-12T15:02:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Gilzane Dantas Nóbrega.pdf: 1294447 bytes, checksum: 21608dde0c9fde9504e79e6652893aa4 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-12T15:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Gilzane Dantas Nóbrega.pdf: 1294447 bytes, checksum: 21608dde0c9fde9504e79e6652893aa4 (MD5) Previous issue date: 2014 / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma doença de caráter zoonótico que reflete em graves problemas à saúde pública. Os cães são os principais reservatórios domésticos do protozoário. No Brasil, uma das formas de controle é a eutanásia dos cães portadores da infecção e nesse contexto, o diagnóstico preciso da LVC é muito importante. Porém, ainda não há um teste altamente sensível e específico, de fácil execução, simples, menos invasivo e de rápido resultado. As avaliações das novas metodologias empregadas para diagnóstico são necessárias ao aprimoramento do programa de controle. Esse estudo teve como objetivo avaliar e comparar dois testes sorológicos que utilizam proteínas recombinantes, sendo um teste imunocromatográfico (TR DPP®) com antígeno rk26/rk39/rk9 e um Ensaio Imunoenzimático (ELISA/S7®) com HSP70 e um teste molecular, a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real para diagnóstico da LVC no Semiárido Paraibano. Foram utilizadas 258 amostras de soro e sangue total divididas em dois grupos: 212 de animais assintomáticos e 46 de animais sintomáticos obtidos durante um levantamento epidemiológico no Semiárido Paraibano. Os resultados mostraram que do total das amostras, 32,9% (85/258) foram positivas em pelo menos um teste, sendo 29,2 % (62/212) dos animais assintomáticos e 50,0% (23/46) dos animais sintomáticos. Os melhores resultados de concordância entre os testes foram obtidos quando realizada a comparação entre a qPCR e o ELISA/S7® mostrando que para animais assintomáticos a sensibilidade e especificidade foi de 74% e 93%, respectivamente e coeficiente Kappa de 0,58, os animais sintomáticos apresentaram sensibilidade de 80% e 81% de especificidade com coeficiente Kappa de 0,51 revelando moderada concordância em ambos os grupos. Com base nos resultados, o ELISA/S7® apresentou um melhor desempenho entre os testes, embora o TR DPP® seja um teste de fácil execução e rápido diagnóstico.

A doença de Chagas acomete entre 6 e 7 milhões de pessoas ao redor do mundo e acredita-se que a mesma seja responsável por 10.000 mortes/ano. A disponibilidade limitada de testes sorológicos sensíveis, específicos e rápidos para a doença dificulta o diagnóstico e o início precoce do tratamento em áreas endêmicas e não endêmicas. Neste estudo, realizou-se a validação de um teste imunocromatográfico rápido para detecção de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgG (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). O desempenho do kit foi comparado ao de um kit comercial que utiliza a mesma metodologia (Comercial A) e às técnicas de ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Foram testadas 664 amostras de soro, as quais foram classificadas como reagentes e não reagentes considerando os resultados concordantes entre as metodologias de ELISA e IFI. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade de 98,5% e especificidade de 99,7%. Utilizando uma amostragem menor (n = 395), o desempenho desse teste rápido foi comparado ao do kit Comercial A. Nesta análise, o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou uma sensibilidade de 98,1% e especificidade de 99,6%, ao passo que os valores de sensibilidade e especificidade encontrados para o kit Comercial A foram 98,7% e 99,6%, respectivamente. Por utilizarem antígenos recombinantes em suas composições e serem realizados em uma única etapa, os testes imunocromatográficos apresentaram sensibilidade inferior aos testes sorológicos convencionais. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade inferior ao kit Comercial A, o que pode ser explicado pelo volume menor de amostra utilizado no primeiro kit e pela reatividade do antígeno recombinante impregnado nos testes. Quando comparado com a literatura, nota-se que o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou desempenho similar ou superior ao de outros testes rápidos disponíveis no mercado (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). A sensibilidade analítica do teste avaliado foi de 0,235 UI/mL, e o kit mostrou ser mais específico frente a amostras reagentes para leishmaniose tegumentar do que a técnica de IFI. O teste manteve seu bom funcionamento oito meses após sua fabricação e após ter sofrido estresse de temperatura. Os resultados desse estudo sugerem que o kit Imuno-Rápido Chagas é capaz de detectar anticorpos da classe IgG anti-T. cruzi, apresentando valores de sensibilidade e especificidade comparáveis aos de outros testes comerciais. Sendo assim, o kit pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico da fase crônica da doença de Chagas. / Around 6 to 7 million people are infected by Chagas disease worldwide, and it is believed that this disease is responsible for 10,000 deaths/year. The lack of sensitive, specific and rapid serological tests for the disease hampers the diagnosis and the start of early treatment in endemic and non-endemic areas. This study validated a rapid immunocromatographic test for detection of IgG antibodies anti-T. cruzi (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). The kit\'s performance was compared to a commercial kit that uses the same methodology (Comercial A), to ELISA and to Indirect Immunofluorescence technique (IFI). A total of 664 serum specimens were tested, which were classified as reactive or non-reactive according to concordant results between ELISA and IFI. The sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.5% and 99.7%, respectively. The performance of this rapid test was compared to Comercial A using a smaller sampling (n = 395). At this analysis, the sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.1% and 99.6%, while the sensitivity and specificity of Comercial A kit were 98.7% and 99.6%, respectively. The immunochromatographic tests have shown lower sensitivity compared to conventional serological tests probably because they use recombinant antigens in their system and are performed in one-step. The Imuno-Rápido Chagas kit has shown lower sensitivity than Comercial A kit, which can be explained by the smaller amount of sample that is used in the first kit and by reactivity of the recombinant antigens used in the tests. Once compared to literature, Imuno-Rápido Chagas kit had the same or better performance than other commercial rapid tests available in the market (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). The analytical sensitivity of the evaluated test in this study was 0.235 IU/mL, and the kit has shown a higher specificity than IFI regarding cutaneous leishmaniasis reactive samples. The test has maintained its good performance eight months after its manufacturing and after a temperature stress. The results of this study indicate that Imuno-Rápido Chagas kit is able to detect IgG antibodies anti-T. cruzi, showing sensitivity and specificity values comparable to other commercial tests. Therefore, the kit can be used to help on diagnosis of chronic phase of Chagas disease.

A leptospirose é uma doença bacteriana infectocontagiosa, de curso agudo ou crônico, causada por espiroquetas do gênero Leptospira, de caráter zoonótico e cosmopolita que acomete o homem e os animais domésticos e silvestres. Pode ser transmitida de forma direta pelo contato com os fluidos contendo leptospiras, através das vias transplacentária e hematogênica, genital e o ato de mamar; ou de forma indireta pelo contato com ambiente contaminado com leptospiras. O conhecimento da gravidade da infecção, da distribuição geográfica, dos fatores de risco e das estirpes circulantes é de extrema importância para o estabelecimento da epidemiologia e o aprimoramento de medidas preventivas e diagnósticas. Neste estudo, avaliou-se a utilização de proteínas recombinantes de Leptospira spp. como antígenos no desenvolvimento de um teste rápido baseado em ensaio imunocromatográfico do tipo dipstick, como método diagnóstico da leptospirose animal. Foram selecionadas 11 proteínas recombinantes como candidatos a antígenos. As proteínas recombinantes purificadas foram avaliadas na detecção de anticorpos específicos por Western-blotting e ELISA. Somente a LipL32 apresentou reatividade com os soros positivos para leptospirose. Dois testes imunocromatográficos, utilizando a proteína LipL32, foram desenvolvidos. Um teste tipo I utilizando a proteína LipL32 conjugada ao ouro coloidal e outro tipo III com o ouro coloidal conjugado a proteína A e a LipL32 na linha teste. Em ambos as linhas teste e controle reagiram, demonstrando que os testes estão funcionando. O teste tipo I realizado manualmente mostrou resultados satisfatórios para os soros bovinos e soro hiperimune de coelho. O tipo III mostrou reatividade para as amostras de soro bovino, equino, coelho e cão. Quando se aplicou este dois testes em máquinas automatizadas não foi possível detectar a linha teste, provavelmente devido a necessidade de nova padronização de todos os parâmetros do método. / Leptospirosis is an infectious bacterial disease of acute or chronic course, caused by spirochetes of the genus Leptospira, with zoonotic and cosmopolitan character, which affects humans, wild and domestic animals. It can be transmitted directly by contact with fluids containing leptospires through placental, hematogenous and genital routes and through the act of breastfeeding; or indirectly by contact with an environment contaminated with leptospires. Acquiring knowledge about the infection severity, the geographical distribution, the risk factors, and the circulating strains is of utmost importance to stablish the epidemiology and to improve preventive and diagnostic measures. In this study, recombinant proteins of Leptospira spp. were evaluated as antigens in the development of a rapid immunochromatographic assay based on the type dipsticks a method of diagnosing animal leptospirosis. 11 recombinant proteins were selected as candidate antigens. The purified recombinant proteins were evaluated in the detection of specific antibodies by Western blotting and ELISA. Only the LipL32 protein showed reactivity with positive sera for leptospirosis. Two immunochromatographic tests, using LipL32 protein, have been developed: a type I test using the LipL32 protein conjugated to colloidal gold and another, type III with colloidal gold conjugated to protein A and LipL32 in the test line. In both assays the test lines and the control lines reacted, showing that the methods are working. The type I test performed manually showed satisfactory results for bovine and hyperimmune rabbit sera. The type III test showed reactivity for bovine, horse, rabbit and dog sera. When these two tests were applied in automated machinery, it has not been possible to detect the line test, probably due to the need for further standardization of all method parameters.

A doença de Chagas acomete entre 6 e 7 milhões de pessoas ao redor do mundo e acredita-se que a mesma seja responsável por 10.000 mortes/ano. A disponibilidade limitada de testes sorológicos sensíveis, específicos e rápidos para a doença dificulta o diagnóstico e o início precoce do tratamento em áreas endêmicas e não endêmicas. Neste estudo, realizou-se a validação de um teste imunocromatográfico rápido para detecção de anticorpos anti-T. cruzi da classe IgG (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). O desempenho do kit foi comparado ao de um kit comercial que utiliza a mesma metodologia (Comercial A) e às técnicas de ELISA e imunofluorescência indireta (IFI). Foram testadas 664 amostras de soro, as quais foram classificadas como reagentes e não reagentes considerando os resultados concordantes entre as metodologias de ELISA e IFI. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade de 98,5% e especificidade de 99,7%. Utilizando uma amostragem menor (n = 395), o desempenho desse teste rápido foi comparado ao do kit Comercial A. Nesta análise, o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou uma sensibilidade de 98,1% e especificidade de 99,6%, ao passo que os valores de sensibilidade e especificidade encontrados para o kit Comercial A foram 98,7% e 99,6%, respectivamente. Por utilizarem antígenos recombinantes em suas composições e serem realizados em uma única etapa, os testes imunocromatográficos apresentaram sensibilidade inferior aos testes sorológicos convencionais. O kit Imuno-Rápido Chagas apresentou sensibilidade inferior ao kit Comercial A, o que pode ser explicado pelo volume menor de amostra utilizado no primeiro kit e pela reatividade do antígeno recombinante impregnado nos testes. Quando comparado com a literatura, nota-se que o kit Imuno-Rápido Chagas apresentou desempenho similar ou superior ao de outros testes rápidos disponíveis no mercado (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). A sensibilidade analítica do teste avaliado foi de 0,235 UI/mL, e o kit mostrou ser mais específico frente a amostras reagentes para leishmaniose tegumentar do que a técnica de IFI. O teste manteve seu bom funcionamento oito meses após sua fabricação e após ter sofrido estresse de temperatura. Os resultados desse estudo sugerem que o kit Imuno-Rápido Chagas é capaz de detectar anticorpos da classe IgG anti-T. cruzi, apresentando valores de sensibilidade e especificidade comparáveis aos de outros testes comerciais. Sendo assim, o kit pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico da fase crônica da doença de Chagas. / Around 6 to 7 million people are infected by Chagas disease worldwide, and it is believed that this disease is responsible for 10,000 deaths/year. The lack of sensitive, specific and rapid serological tests for the disease hampers the diagnosis and the start of early treatment in endemic and non-endemic areas. This study validated a rapid immunocromatographic test for detection of IgG antibodies anti-T. cruzi (Imuno-Rápido Chagas, WAMA Diagnóstica). The kit\'s performance was compared to a commercial kit that uses the same methodology (Comercial A), to ELISA and to Indirect Immunofluorescence technique (IFI). A total of 664 serum specimens were tested, which were classified as reactive or non-reactive according to concordant results between ELISA and IFI. The sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.5% and 99.7%, respectively. The performance of this rapid test was compared to Comercial A using a smaller sampling (n = 395). At this analysis, the sensitivity and specificity of Imuno-Rápido Chagas kit were 98.1% and 99.6%, while the sensitivity and specificity of Comercial A kit were 98.7% and 99.6%, respectively. The immunochromatographic tests have shown lower sensitivity compared to conventional serological tests probably because they use recombinant antigens in their system and are performed in one-step. The Imuno-Rápido Chagas kit has shown lower sensitivity than Comercial A kit, which can be explained by the smaller amount of sample that is used in the first kit and by reactivity of the recombinant antigens used in the tests. Once compared to literature, Imuno-Rápido Chagas kit had the same or better performance than other commercial rapid tests available in the market (SÁNCHEZ-CAMARGO et al., 2014). The analytical sensitivity of the evaluated test in this study was 0.235 IU/mL, and the kit has shown a higher specificity than IFI regarding cutaneous leishmaniasis reactive samples. The test has maintained its good performance eight months after its manufacturing and after a temperature stress. The results of this study indicate that Imuno-Rápido Chagas kit is able to detect IgG antibodies anti-T. cruzi, showing sensitivity and specificity values comparable to other commercial tests. Therefore, the kit can be used to help on diagnosis of chronic phase of Chagas disease.

A brucelose causada pela B. canis constitui uma infecção sistêmica e zoonótica que acomete principalmente os cães, causando problemas reprodutivos. O diagnóstico da infecção é difícil, sendo necessária a associação do diagnóstico clínico aos métodos laboratoriais diretos e indiretos para sua confirmação. Um dos problemas relativos ao diagnóstico laboratorial está relacionado à ausência de marcadores que possibilitem a identificação acurada de cães em ausência de bacteremia. A partir do exposto, foi realizado um estudo com o objetivo de avaliar o desempenho de testes laboratoriais diretos e indiretos como marcadores da infecção por B. canis em cães e determinar a combinação de testes que possibilite o diagnóstico da brucelose canina com maiores valores de sensibilidade e especificidade. Foram coletadas amostras de sangue, soro e aspirado de linfonodo de 92 cães, sem distinção de sexo, idade ou raça, incluindo cães reprodutores e não reprodutores. A hemocultura e a reação em cadeia pela polimerase (PCR) foram previamente realizadas nas amostras de sangue e, com base nos resultados, os 92 animais foram divididos em dois grupos: infectados (n=37) e não infectados (n= 55). Em seguida, as amostras de aspirado de linfonodo foram submetidas à PCR e ao cultivo microbiológico e as amostras de soro foram testadas por um ensaio imunocromatográfico (EIC). A partir dos resultados obtidos, a sensibilidade e especificidade diagnóstica dos testes foram calculadas utilizando os grupos infectados e não infectados, respectivamente. O coeficiente Kappa foi usado para calcular a concordância entres os testes laboratoriais e suas combinações. A proporção de resultados positivos foi de 40,2% (37/92) para os testes diretos em amostras de sangue, 29% (27/92) e 25% (23/92) para PCR e cultivo em amostras de aspirado de linfonodo, respectivamente, e 43% (40/92) para o EIC. A concordância entre os testes variou de moderada a quase perfeita. A sensibilidade e especificidade diagnóstica foram, respectivamente, 65% e 95% para PCR em amostras de aspirado de linfonodo, 62% e 100% para o cultivo microbiológico em amostras de aspirado de linfonodo e 92% e 89% para o EIC. A PCR em amostras de aspirados de linfonodos apresentou maior sensibilidade em relação ao cultivo aplicado a estas amostras, sendo uma alternativa ao diagnóstico microbiológico. A associação entre os testes de PCR em amostras de aspirados de linfonodos e de sangue e o EIC possibilitou um aumento da sensibilidade diagnóstica, por possibilitar a identificação de cães na ausência e na presença de bacteremia, com maior rapidez. / Brucellosis caused by B. canis is a systemic and zoonotic infection characterized by prolonged bacteremia that affects mainly dogs causing reproductive problems. The diagnosis of the infection is quite difficult, being necessary the association of the clinical diagnosis with direct and indirect laboratory methods to confirm the infection. The main drawback regarding the laboratory diagnosis relies on the lack of markers that allow the accurate identification of non bacteremic dogs. From the above, a study was carried out to evaluate the performance of direct and indirect laboratory tests as markers for B. canis infection in dogs and to determine the combination of tests that allows the diagnosis of the infection with higher values of sensitivity and specificity. Samples of blood, serum and lymph node aspirates were collected from 92 dogs, regardless the sex, age or breed, including pet and breeding dogs. All the dogs were tested using culturing and the polymerase chain reaction (PCR) in blood samples and, based on the results, they were divided into two groups: infected (n = 37) and non-infected (n = 55). Lymph node aspirates were tested through PCR and microbiological culturing, and serum samples using an immunochromatographic assay (EIC). The infected and uninfected groups were used to calculate, respectively, the sensitivity and specificity of the tests. The agreement between the tests was calculated using Kappa coefficient. The proportion of positive results was 40.2% (37/92) for the direct tests in blood samples, 29% (27/92) and 25% (23/92) for PCR and lymph node culturing, respectively, and 43% (40/92) for the EIC. The agreement between the tests ranged from moderate to near perfect. The sensitivity and specificity was, respectively, 65% and 95% for PCR in lymph node aspirates, 62% and 100% for lymph node culturing, and 92% and 89% for EIC. The PCR in lymph node aspirates showed a higher sensitivity when compared to the lymph node culturing, being an alternative to the microbiological diagnosis. The association between PCR in blood and lymph node aspirates and the EIC enabled an increased sensitivity in the diagnosis with the identification of non-bacteremic dogs more rapidly.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-07T16:03:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoNivelConcordancia.pdf: 1258819 bytes, checksum: 6d1ffa3e55c412538882010cdc01808f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-13T16:58:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoNivelConcordancia.pdf: 1258819 bytes, checksum: 6d1ffa3e55c412538882010cdc01808f (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-13T16:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AvaliacaoNivelConcordancia.pdf: 1258819 bytes, checksum: 6d1ffa3e55c412538882010cdc01808f (MD5) Previous issue date: 2007 / O diagnóstico precoce e o tratamento adequado dos casos de malária é a principal estratégia para o controle da doença. Várias alternativas para o diagnóstico microscópico tradicional foram propostas nos últimos anos, os testes imunocromatográficos que capturam antígenos alvos dos parasitos da malária estão sendo propostos, como o teste OptiMAL-IT® que detecta a desidrogenase lática do Plasmodium sp.. O estudo teve como objetivo a avaliação do nível de concordância entre o teste imunocromatográfico (OptiMAL-IT®) e a gota espessa para o diagnóstico da malária no Município de Mazagão – Amapá. Foram analisados 413 indivíduos com sintomatologia de malária, que procuraram o serviço da Unidade Mista de Saúde de Mazagão, com idade entre 01-68 anos. Os resultados do teste OptiMAL-IT® foram comparados com os resultados obtidos (das amostras) através da gota espessa corada pelo Giemsa. Dos 413 pacientes suspeitos de apresentarem malária, 317(76.8%) eram positivos através da GE e 311 (75.3%) eram positivos pelo TDR. Das lâminas de GE positivas, foram encontrados 27.4% de P. falciparum e 72.6% de P. vivax. O teste OptiMAL-IT® detectou 27.7% de P. falciparum e 72.3% de P. vivax. A sensibilidade obtida com o TDR para o P. falciparum foi de 97.7% e para o P. vivax foi de 98.2%, a sensibilidade global do TDR foi de 98.1% e a especificidade global e para ambas as espécies foi de 100%. Foram encontrados valores preditivos positivos e negativos de 100% e 94.1%, respectivamente. O teste OptiMAL-IT®, teve uma alta concordância com a GE, foi específico e eficiente, podendo ser usado no diagnóstico de malária nas situações onde a microscopia não está disponível. / The precocious diagnosis and the opportune treatment of the cases of malaria is one of the main strategies for the control of the disease. Several alternatives for the traditional microscopic diagnosis were proposed in the last years, the Immunochromatographic tests that capture white antigens of the parasites of the malaria they are being proposed, as the test OptiMAL-IT® that captures the lactic desidrogenase of the Plasmodium sp.. The study had as objective the evaluation of the level of agreement between the Immunochromatographic test (OptiMAL-IT®) and the thick drop for the diagnosis of the malaria in the City of Mazagão – Amapá, Brazil. 413 individuals were analyzed with malaria sintomatology that had looked for the service of the unit of health service of the city, with age among 01-68 years. The results of the OptiMAL-IT® test were compared with the obtained results, of the same samples, through the thick drop red-faced by the Giemsa. Of the 413 patients suspicious to present malaria, 317(76.8%) were positive through GE and 311 (75.3%) were positive for TDR OptiMAL-IT®. Of the positive blades of GE, had been found 27.4% of P. falciparum and 72.6% of P. vivax . The OptiMAL-IT® test detected 27.7% of P. falciparum and 72.3% of P. vivax. The sensibility obtained with TDR for P. falciparum was of 97.7% and for P. vivax was of 98.2%, the global sensibility of TDR was of 98.1% and the global specificity for both the species was of 100%. They were found preditivos values positive and negative of 100% and 94.1%, respectively. The OptiMAL-IT® test had a high agreement with thick drop, it is specific and efficient. It can be used in the diagnosis of malaria in the situations where microscopy is not available.

A brucelose causada pela B. canis constitui uma infecção sistêmica e zoonótica que acomete principalmente os cães, causando problemas reprodutivos. O diagnóstico da infecção é difícil, sendo necessária a associação do diagnóstico clínico aos métodos laboratoriais diretos e indiretos para sua confirmação. Um dos problemas relativos ao diagnóstico laboratorial está relacionado à ausência de marcadores que possibilitem a identificação acurada de cães em ausência de bacteremia. A partir do exposto, foi realizado um estudo com o objetivo de avaliar o desempenho de testes laboratoriais diretos e indiretos como marcadores da infecção por B. canis em cães e determinar a combinação de testes que possibilite o diagnóstico da brucelose canina com maiores valores de sensibilidade e especificidade. Foram coletadas amostras de sangue, soro e aspirado de linfonodo de 92 cães, sem distinção de sexo, idade ou raça, incluindo cães reprodutores e não reprodutores. A hemocultura e a reação em cadeia pela polimerase (PCR) foram previamente realizadas nas amostras de sangue e, com base nos resultados, os 92 animais foram divididos em dois grupos: infectados (n=37) e não infectados (n= 55). Em seguida, as amostras de aspirado de linfonodo foram submetidas à PCR e ao cultivo microbiológico e as amostras de soro foram testadas por um ensaio imunocromatográfico (EIC). A partir dos resultados obtidos, a sensibilidade e especificidade diagnóstica dos testes foram calculadas utilizando os grupos infectados e não infectados, respectivamente. O coeficiente Kappa foi usado para calcular a concordância entres os testes laboratoriais e suas combinações. A proporção de resultados positivos foi de 40,2% (37/92) para os testes diretos em amostras de sangue, 29% (27/92) e 25% (23/92) para PCR e cultivo em amostras de aspirado de linfonodo, respectivamente, e 43% (40/92) para o EIC. A concordância entre os testes variou de moderada a quase perfeita. A sensibilidade e especificidade diagnóstica foram, respectivamente, 65% e 95% para PCR em amostras de aspirado de linfonodo, 62% e 100% para o cultivo microbiológico em amostras de aspirado de linfonodo e 92% e 89% para o EIC. A PCR em amostras de aspirados de linfonodos apresentou maior sensibilidade em relação ao cultivo aplicado a estas amostras, sendo uma alternativa ao diagnóstico microbiológico. A associação entre os testes de PCR em amostras de aspirados de linfonodos e de sangue e o EIC possibilitou um aumento da sensibilidade diagnóstica, por possibilitar a identificação de cães na ausência e na presença de bacteremia, com maior rapidez. / Brucellosis caused by B. canis is a systemic and zoonotic infection characterized by prolonged bacteremia that affects mainly dogs causing reproductive problems. The diagnosis of the infection is quite difficult, being necessary the association of the clinical diagnosis with direct and indirect laboratory methods to confirm the infection. The main drawback regarding the laboratory diagnosis relies on the lack of markers that allow the accurate identification of non bacteremic dogs. From the above, a study was carried out to evaluate the performance of direct and indirect laboratory tests as markers for B. canis infection in dogs and to determine the combination of tests that allows the diagnosis of the infection with higher values of sensitivity and specificity. Samples of blood, serum and lymph node aspirates were collected from 92 dogs, regardless the sex, age or breed, including pet and breeding dogs. All the dogs were tested using culturing and the polymerase chain reaction (PCR) in blood samples and, based on the results, they were divided into two groups: infected (n = 37) and non-infected (n = 55). Lymph node aspirates were tested through PCR and microbiological culturing, and serum samples using an immunochromatographic assay (EIC). The infected and uninfected groups were used to calculate, respectively, the sensitivity and specificity of the tests. The agreement between the tests was calculated using Kappa coefficient. The proportion of positive results was 40.2% (37/92) for the direct tests in blood samples, 29% (27/92) and 25% (23/92) for PCR and lymph node culturing, respectively, and 43% (40/92) for the EIC. The agreement between the tests ranged from moderate to near perfect. The sensitivity and specificity was, respectively, 65% and 95% for PCR in lymph node aspirates, 62% and 100% for lymph node culturing, and 92% and 89% for EIC. The PCR in lymph node aspirates showed a higher sensitivity when compared to the lymph node culturing, being an alternative to the microbiological diagnosis. The association between PCR in blood and lymph node aspirates and the EIC enabled an increased sensitivity in the diagnosis with the identification of non-bacteremic dogs more rapidly.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-04-22T19:57:28Z No. of bitstreams: 2 Tese - Mauro Roberto Biá da Silva - 2014.pdf: 1034991 bytes, checksum: 33b9d1a7520d55b9ed3fc8220c32caae (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-04-22T19:58:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Mauro Roberto Biá da Silva - 2014.pdf: 1034991 bytes, checksum: 33b9d1a7520d55b9ed3fc8220c32caae (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-22T19:58:56Z (GMT). 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The LV diagnosis is dificult, mainly for patients co infected with HIV, because LV paients present atipical clinic forms and the sorology is not trustfull Objectives: The aim of this thesis is to evaluate the accuracy of Immunochromatographic rK39 tests in the diagnosis of Visceral Leishmaniasis in serum and saliva of HIV-co-infected patients Methods: VL suspected patients were treated at the Institute of Tropical Diseases Natan Portela - IDTNP, Teresina, Piauí, Brazil, from March 2011 to October 2012. In addition to the clinical examination, it was performed the IC rK39 test in saliva and blood and also the bone marrow aspiration for parasitological and the PCR-RFLP tests. As routine in the institution, VL suggestive patients were also investigated for HIV. Bone marrow samples were collected for Leishmania research in smear, culture and PCR. For the research of Leishmania spp. in bone marrow aspirate, the Panoptic stain was used (RANYLAB Pharmaceutical Chemistry). The analyses of the stained slides were done in an optical microscope with immersion objective, magnification of 1000x. To perform the bone marrow aspirate culture, the aspirate was cultivated in 3 mL of NNN medium (McNeal, Novy & Nicolle) and 500 μL Schneider medium at 26°C. The search for promastigotes. was performed every seven days in blade - cover slip in an optical microscope. 5 mL were collected from peripheral blood in Vaccutainer® tubes without any anticoagulant in order to obtain the serum. Sera were then aliquoted in cryoassay tubes and kept in a freezer at -70°C. Saliva was collected in 50 mL polypropylene tubes and, in order to increase the amount of saliva, the patients received a piece of Parafilm® for chewing. Saliva was aliquoted in cryoessay tubes and kept in a freezer at -70°C. Results: VL patients who possessed the IC rK39 test with positive serum showed 58.6% of positivity (n = 17) in saliva (SalPos), while all of the healthy donors (CT) (n = 20) were negative in serum and saliva. The amount of total and specific IgG in the serum of patients with VL was significantly higher than that in the CT group. The specific IgG of the SalPos group was greater than in VL patients with negative saliva (SalNeg), but it was not statistically xv significant. The amount of total or specific IgA was similar in all groups. The amount of specific IgG for Leishmania found in saliva of both the SalPos and SalNeg groups was higher than in the control group, but the group with SalPos saliva presented more specific IgG to Leishmania than the SalNeg group. Among the 86 VL patients, 33 had positive serology for HIV and five tested negative serology, however, they were carriers of the virus and were being treated, totalizing 37 infected individuals. The sensitivity of VL in PCR was of 100%, since this test was considered gold standard in this study. The other tests had sensitivity of 57.14% (n = 49) (bone marrow aspiration culture), 48.71% (n = 78) (marrow aspirate smear analysis), 55.81% (n = 86) and 56 25% (n = 85) for the IC rK39 tests in Orangelife or Kalazar Detect serum, respectively. In the case of using the parasitological test as the gold standard, the sensitivity of serological tests was greater than 82%. It is not clear if HIV infection is able to interfere in the serological tests yet. Conclusions: The rK39 IC tests, with the utilization of serum, have a low sensitivity when applied to patients co-infected with HIV and VL, and the use of saliva for VL diagnosis is limited. / Introdução: A Leishmaniose Visceral (LV) é uma antropozoonose causada por protozoários do gênero Leishmania, especialmente Leishmania (Leishmania) infantum ou Leishmania (Leishmania) donovani. Está presente em regiões tropicais e subtropicais e é considerada uma doença negligenciada. O diagnóstico preciso da LV é geralmente difícil, principalmente em pacientes coinfectados pelo HIV, porque a LV apresenta formas clínicas atípicas e porque o diagnóstico sorológico se torna pouco confiável. Objetivo: Avaliar a acurácia de Testes Imunocromatográficos rK39 no diagnóstico da LV em soro e saliva de pacientes coinfectados com HIV. Métodos: Pacientes suspeitos de LV foram atendidos no Instituto de Doenças Tropicais Natan Portela - IDTNP, Teresina, Piauí, Brasil, no período de março de 2011 a outubro de 2012. Além do exame clínico, foi realizado o teste IC rK39 em saliva e sangue, aspiração de medula óssea para exames parasitológicos e PCR- RFLP. Como rotina na instituição, pacientes sugestivos de LV também foram investigados para HIV. Foram coletadas amostras de medula óssea para pesquisa de Leishmania em esfregaço, cultura e PCR. Para pesquisa de Leishmania spp. em aspirado de medula óssea, utilizou-se a coloração pelo Panótico (RANYLAB Química Farmacêutica). A leitura das lâminas coradas foi realizada em microscópio óptico com objetiva de imersão, aumento de 1000x. Para realização da cultura de aspirado de medula óssea, o aspirado foi cultivado em 3 mL de meio NNN (McNeal, Novy & Nicolle) e 500 μL de meio Schneider a 26ºC. A pesquisa de formas promastigotas de Leishmania spp. foi realizada a cada sete dias em lâmina – lamínula em microscópio óptico. Foram coletados 5 mL de sangue periférico em tubos Vaccutainer® sem anticoagulante para obtenção do soro. Em seguida, os soros foram aliquotados em tubos de crioensaio e mantidos em freezer a -70ºC. A saliva foi recolhida em tubos de polipropileno de 50 mL e para aumentar a quantidade de saliva, os pacientes receberam um pedaço de Parafilm® para mastigar. A saliva foi aliquotada em tubos de crioensaio e mantidas em freezer a -70ºC. Resultados: Pacientes com LV que possuiam o teste IC rK39 positivo no soro, apresentaram uma positividade de 58,6% (n = 17) na saliva (SalPos), enquanto todos os doadores saudáveis (CT) (n = 20) foram negativos no soro e na saliva. A quantidade de IgG total e específica no soro do paciente com LV foi significativamente mais elevada do que no grupo CT. A IgG xiii específica do grupo SalPos foi maior do que no grupo de pacientes com LV com saliva negativa (SalNeg), mas não foi estatisticamente significativa. A quantidade de IgA total ou específica foi semelhante em todos os grupos. A quantidade de IgG específica para Leishmania observada na saliva de ambos os grupos SalPos e SalNeg foi maior do que no grupo controle, mas o grupo com saliva SalPos apresentou mais IgG específico para Leishmania do que o grupo SalNeg. Dos 86 pacientes com LV, 33 possuíam sorologia positiva para HIV, cinco apresentaram sorologia negativa, porém, eram portadores do vírus e estavam em tratamento, totalizando 37 indivíduos infectados. A sensibilidade para LV na PCR foi de 100%, já que este foi o teste considerado ouro neste estudo. Os demais testes tiveram sensibilidade de 57,14% (n= 49) (cultura de aspirado medular), 48,71% (n = 78) (análise de esfregaço de aspirado medular), 55,81% (n = 86) e 56,25% (n = 85) para os testes IC rK39 no soro Orangelife ou Kalazar Detect respectivamente. No caso do uso do teste parasitológico como padrão ouro, a sensibilidade dos testes sorológicos foi superior a 82%. Ainda não está bem esclarecido se a infecção pelo HIV é capaz de interferir nos testes sorológicos. Conclusões: Os testes IC rK39, com utilização de soro, tem uma baixa sensibilidade quando aplicados a pacientes coinfectados com LV-HIV, e o uso da saliva para o diagnóstico da LV é limitado.