A leptospirose é uma doença bacteriana infectocontagiosa, de curso agudo ou crônico, causada por espiroquetas do gênero Leptospira, de caráter zoonótico e cosmopolita que acomete o homem e os animais domésticos e silvestres. Pode ser transmitida de forma direta pelo contato com os fluidos contendo leptospiras, através das vias transplacentária e hematogênica, genital e o ato de mamar; ou de forma indireta pelo contato com ambiente contaminado com leptospiras. O conhecimento da gravidade da infecção, da distribuição geográfica, dos fatores de risco e das estirpes circulantes é de extrema importância para o estabelecimento da epidemiologia e o aprimoramento de medidas preventivas e diagnósticas. Neste estudo, avaliou-se a utilização de proteínas recombinantes de Leptospira spp. como antígenos no desenvolvimento de um teste rápido baseado em ensaio imunocromatográfico do tipo dipstick, como método diagnóstico da leptospirose animal. Foram selecionadas 11 proteínas recombinantes como candidatos a antígenos. As proteínas recombinantes purificadas foram avaliadas na detecção de anticorpos específicos por Western-blotting e ELISA. Somente a LipL32 apresentou reatividade com os soros positivos para leptospirose. Dois testes imunocromatográficos, utilizando a proteína LipL32, foram desenvolvidos. Um teste tipo I utilizando a proteína LipL32 conjugada ao ouro coloidal e outro tipo III com o ouro coloidal conjugado a proteína A e a LipL32 na linha teste. Em ambos as linhas teste e controle reagiram, demonstrando que os testes estão funcionando. O teste tipo I realizado manualmente mostrou resultados satisfatórios para os soros bovinos e soro hiperimune de coelho. O tipo III mostrou reatividade para as amostras de soro bovino, equino, coelho e cão. Quando se aplicou este dois testes em máquinas automatizadas não foi possível detectar a linha teste, provavelmente devido a necessidade de nova padronização de todos os parâmetros do método. / Leptospirosis is an infectious bacterial disease of acute or chronic course, caused by spirochetes of the genus Leptospira, with zoonotic and cosmopolitan character, which affects humans, wild and domestic animals. It can be transmitted directly by contact with fluids containing leptospires through placental, hematogenous and genital routes and through the act of breastfeeding; or indirectly by contact with an environment contaminated with leptospires. Acquiring knowledge about the infection severity, the geographical distribution, the risk factors, and the circulating strains is of utmost importance to stablish the epidemiology and to improve preventive and diagnostic measures. In this study, recombinant proteins of Leptospira spp. were evaluated as antigens in the development of a rapid immunochromatographic assay based on the type dipsticks a method of diagnosing animal leptospirosis. 11 recombinant proteins were selected as candidate antigens. The purified recombinant proteins were evaluated in the detection of specific antibodies by Western blotting and ELISA. Only the LipL32 protein showed reactivity with positive sera for leptospirosis. Two immunochromatographic tests, using LipL32 protein, have been developed: a type I test using the LipL32 protein conjugated to colloidal gold and another, type III with colloidal gold conjugated to protein A and LipL32 in the test line. In both assays the test lines and the control lines reacted, showing that the methods are working. The type I test performed manually showed satisfactory results for bovine and hyperimmune rabbit sera. The type III test showed reactivity for bovine, horse, rabbit and dog sera. When these two tests were applied in automated machinery, it has not been possible to detect the line test, probably due to the need for further standardization of all method parameters.

A imunização transcutânea (TCI) é uma via atrativa para o desenvolvimento de vacinação livre de agulhas, atuando nas APCs da pele, podendo substituir algumas das imunizações convencionais, em termos de facilidade, segurança e eficácia. O presente estudo avaliou a resposta imune da TCI com proteína recombinante de leptospira LipL32, uma proteína altamente conservada em cepas patogênicas e potente candidata vacinal. A TCI com a LipL32 na região abdominal de C57BL-6 foi capaz de primar o sistema imune, suscitando resposta sistêmica com altos níveis de anticorpos contra o antígeno, após reforços subimunizantes, ID e Tc. O padrão de citocinas em cultivo de células do sangue total dos grupos imunizados indicou que a imunização Tc foi capaz de primar o sistema imune, tanto inato quanto adaptativo. O tratamento local ou a coadministração com surfactantes ou PEG não evidenciou ação emoliente ou adjuvante. A coadministração Tc da LipL32 com MPL-A levou a efeito moderador da reação pro-inflamatória, redirecionando a resposta adaptativa, tanto humoral quanto celular. / Transcutaneous immunization (TCI) offers an attractive pathway for the development of needle-free vaccination by acting on APCs of the skin, showing potential to replace conventional immunization, in terms of safety and efficacy. In this study we evaluated the immune response by TCI with recombinant protein of leptospira LipL32, a highly conserved protein among pathogenic strains, a potential vaccine candidate. TCI with LipL32 was evaluated in C57BL-6 mice abdominal region and was able to confer systemic response with high levels of antibodies after subimmunizing ID and Tc boosters. The pattern of cytokines in cell cultures from whole blood of immunized groups indicated that the TCI was able to prime the immune system, for both innate and adaptive response. Local treatment of the skin or coadministration with surfactants and PEG did not show an emollient and an adjuvant action. Co-administration of LipL32 with MPL-A influenced the antibody response as well as showed a moderating effect of the pro-inflammatory reaction, redirecting the adaptive response.

A imunização transcutânea (TCI) é uma via atrativa para o desenvolvimento de vacinação livre de agulhas, atuando nas APCs da pele, podendo substituir algumas das imunizações convencionais, em termos de facilidade, segurança e eficácia. O presente estudo avaliou a resposta imune da TCI com proteína recombinante de leptospira LipL32, uma proteína altamente conservada em cepas patogênicas e potente candidata vacinal. A TCI com a LipL32 na região abdominal de C57BL-6 foi capaz de primar o sistema imune, suscitando resposta sistêmica com altos níveis de anticorpos contra o antígeno, após reforços subimunizantes, ID e Tc. O padrão de citocinas em cultivo de células do sangue total dos grupos imunizados indicou que a imunização Tc foi capaz de primar o sistema imune, tanto inato quanto adaptativo. O tratamento local ou a coadministração com surfactantes ou PEG não evidenciou ação emoliente ou adjuvante. A coadministração Tc da LipL32 com MPL-A levou a efeito moderador da reação pro-inflamatória, redirecionando a resposta adaptativa, tanto humoral quanto celular. / Transcutaneous immunization (TCI) offers an attractive pathway for the development of needle-free vaccination by acting on APCs of the skin, showing potential to replace conventional immunization, in terms of safety and efficacy. In this study we evaluated the immune response by TCI with recombinant protein of leptospira LipL32, a highly conserved protein among pathogenic strains, a potential vaccine candidate. TCI with LipL32 was evaluated in C57BL-6 mice abdominal region and was able to confer systemic response with high levels of antibodies after subimmunizing ID and Tc boosters. The pattern of cytokines in cell cultures from whole blood of immunized groups indicated that the TCI was able to prime the immune system, for both innate and adaptive response. Local treatment of the skin or coadministration with surfactants and PEG did not show an emollient and an adjuvant action. Co-administration of LipL32 with MPL-A influenced the antibody response as well as showed a moderating effect of the pro-inflammatory reaction, redirecting the adaptive response.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_claudia_fernandes.pdf: 1692742 bytes, checksum: 5395743de930fc1ac7ec3c75eaab4e86 (MD5) Previous issue date: 2008-02-15 / Leptospirosis is a zoonotic disease that occurs all over the world and is caused by pathogenic bacteria of the genus Leptospira. Clinical manifestations of leptospirosis are similar to other febrile illnesses and this fact frequently retards beginning of antibiotic therapy. Thus, early and accurate diagnosis is a prerequisite for proper treatment of leptospirosis. Pathogenic serovars of Leptospira have a wide antigenic diversity attributed mainly to the lipopolysacharide present in the outer membrane. In contrast, antigens conserved among pathogenic serovars are mainly represented by outer membrane proteins. Surface exposure of a major and highly conserved outer membrane lipoprotein (LipL32) was recently demonstrated on pathogenic Leptospira. LipL32 on its recombinant form (rLipL32) was used to immunize BALB/c mice to develop murine monoclonal antibodies (mAbs). Three mAbs against rLipL32 were produced, isotyped and evaluated for further use in diagnostic tests of leptospirosis using different approaches. The mAbs were conjugated to peroxidase and evaluated in a native protein ELISA with intact and heat-treated leptospiral cells, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) for direct immunofluorescence with intact and methanol fixed cells and were used for LipL32 immunoprecipitation from leptospiral cells. rLipL32 mAbs conjugated to peroxidase or used as primary antibody bounded to intact and heat-treated cells in ELISA, proving that they could be used in enzyme immunoassays for detection of the native protein. On immunofluorescence assay, mAbs labeled bacterial cells either intact or methanol fixed. Two mAbs were able to immunoprecipitate the native protein from live and motile leptospiral cells and, adsorbed onto magnetic beads, captured intact bacteria from artificially contaminated human sera for detection by PCR amplification. One mAb was utilized for the development of an immunoseparation assay coupled to PCR test (IMS/PCR) for diagnosis of leptospirosis. The antibody adsorved onto magnetic beads captured leptospires from urine and human sera artificially contaminated for further amplification of the lipL32 gene by PCR. To ensure PCR accuracy, an internal amplification control (IAC) was constructed using as amplification targets sequences of standardized primers specific for pathogenic Leptospira and for a not-related DNA sequence. The IMS/PCR IAC method developed was able to detect 102 cells per mL of sera or urine, corresponding to approximately 25 genomic copies per reaction. These results suggest that the association of LipL32-based immunochemical and molecular techniques could yield a novel method for the diagnosis of leptospirosis. Moreover, immunomagnetic separation with mAbs against LipL32 can be used previous to amplification of other targets in the Leptospira genome by PCR. / A Leptospirose é uma zoonose de ocorrência mundial causada por bactérias do gênero Leptospira. As manifestações clínicas da leptospirose são similares a outras doenças febris e este fato frequentemente atrasa o diagnóstico e o início do tratamento. Portanto, o diagnóstico precoce e acurado da doença é um prerequisito para o tratamento adequado. Sorovares patogêncios de Leptospira possuem uma grande variação antigência e esta diversidade é atribuída principalmente ao lipopolissacarídeo presente na membrana externa. Contrastando com esta característica, antígenos conservados de sorovares patogênicos são principalmente representados por proteínas de membrana externa. Recentemente foi comprovada a exposição da proteína LipL32 na superfície da membrana externa de leptospiras patogênicas. Neste estudo, LipL32 em sua forma recombinante (rLipL32) foi utilizada para imunizar camundongos BALB/c e produzir anticorpos monoclonais (mAbs). Três mAbs contra rLipL32 foram produzidos e caracterizados quanto ao seu potencial para uso em testes diagnósticos usando diferentes metodologias. Os mAbs foram conjugados à peroxidase e avaliados quanto a reação com proteina nativa em células de leptospiras íntegras e rompidas, conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) para uso em imunofluorescência para marcar células de leptospira intactas e tratadas com metanol, e usados para imunoprecipitar células de leptospira. Os anticorpos monoclonais anti-LipL32, utilizados em ELISA tanto conjugados com peroxidase ou como anticorpo primário, ligaram-se às células de leptospiras intactas ou rompidas pelo calor, provando que podem ser usados em testes imunoenzimáticos para detecção da proteína nativa. Na imunofluorescência, os mAbs foram capazes de marcar células da bactéria tanto intactas como fixadas com metanol. Dois mAbs foram capazes de imunoprecipitar proteina nativa de leptospiras vivas e móveis, e quando adsorvidos em partículas magnéticas foram capazes de capturar bactérias para amplificação por PCR. Na seqüência deste estudo, o mAb 1D9 foi utilizado em estudos de padronização da metodologia de imunoseparação magnética associada a PCR (IMS/PCR) para diagnóstico de leptospirose. O anticorpo 1D9 foi adsorvido em partículas magnéticas e utilizado para capturar leptospiras em soro e urina humanas artificialmente contaminadas com leptospiras para posterior amplificação. Para assegurar a acurácia da PCR foi construído um controle interno de amplificação (IAC) específico para a metodologia desenvolvida utilizando como alvo sequências de primers já padronizados para exclusiva amplificação de leptospiras patogências e uma sequencia de DNA não relacionada. A metodologia de IMS/PCR IAC permitiu usar somente um par de primers na reação de PCR e mostrou ser promissora para diagnóstico de leptospirose, pois foi capaz de detectar 102 células por mL em amostras de soro e urina artificialmente contaminadas, correspondendo a amplificação a partir de aproximadamente 25 cópias do genoma. Os resultados obtidos evidenciam uma nova perspectiva no diagnóstico da leptospirose através da utilização da proteína LipL32 em métodos imunoquímicos e moleculares ou pela associação destas metodologias. A metodologia de imunoseparação com o mAb anti-LipL32 pode ser utilizada previamente a amplificação de outros alvos do genoma bacteriano por PCR, já que ela possibilita a separação e concentração exclusiva de Leptospira patogênica.

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Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_andre_grassmann.pdf: 1497268 bytes, checksum: 73f55a329ef2c9be70227b63b45785a2 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Leptospirosis is an infectious disease that affects humans, wild and domestic animals worldwide. Pathogenic spirochetes from the Leptospira genus are the causative agents of this zoonosis. The several Leptospira species have noted antigenic diversity, even within the same species. This is the main reason current bacterin vaccines have limitations, such as adverse effects and short term immunity, restricting their use in human populations. The need for effective leptospirosis vaccines promoted studies on characterization of new vaccine candidates. The 32 kDa outer membrane lipoprotein, LipL32, is the most abundant protein in the whole leptospira proteome, it is conserved in all pathogenic serovars and absent in saprophytes. This protein is immunogenic and able to bind to mammalian extracellular matrix. However, LipL32 subunit vaccines did not protect animals against challenge. In an attempt to solve this, we use LipL32 fused and coadministered with B subunit of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LTB) to enhance the immune response. LTB is a non-toxic molecule with immunoestimulatory and immunomodulatory properties. The recombinant proteins rLTB, rLipL32 and rLTB::LipL32 were expressed in E. coli, purified and characterized. Female hamsters were distributed in groups as follows: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, homologous bacterin; PBS. The serum from each animal was collected for humoral immune response determination by ELISA. The animals were challenged with 5×LD50 dose of Leptospira interrogans strain Fiocruz L1-130. Both treatments induced high titers of anti-rLipL32 antibodies. The rLTB+rLipL32 and rLTB::LipL32 treatments afforded significant protective response upon challenge, when compared to control groups (p<0.05). No prior study with leptospirosis had used LTB as the adjuvant, or fused antigens in an attempt to control this disease. Furthermore, this is the first report of a protective subunit vaccine using rLipL32 as the antigen, and an important contribution towards the development of improved leptospirosis vaccines. / A leptospirose é uma doença infecciosa que afeta humanos e animais silvestres e domésticos em todo mundo. As espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira são os agentes causadores desta zoonose. As diversas espécies de leptospiras possuem notada diversidade antigênica, inclusive em uma mesma espécie. Esta característica resulta em limitação das atuais vacinas bacterinas que não induzem proteção cruzada entre os diferentes sorovares. Além disso, estas vacinas geram efeitos adversos e imunidade de curta duração, restringindo seu uso em populações humanas. A necessidade de novas vacinas eficazes contra a leptospirose estimulou estudos para caracterizar novos antígenos vacinais. A lipoproteína de membrana externa de 32 kDa, LipL32 é a proteína mais abundante no proteoma total da leptospira, conservada entre todos os sorovares patogênicos e ausente nas leptospiras saprófitas. Esta proteína é imunogênica e possui habilidade de ligar-se à matriz extracelular de mamíferos. Porém, animais inoculados com vacinas de subunidade utilizando LipL32 não sobrevivem ao desafio. Em função disso, utilizamos LipL32 fusionada e co-administrada com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB) para melhorar a resposta imune. LTB é uma molécula atóxica com reconhecida atividade imunoestimuladora e imunomoduladora. As proteínas recombinantes rLTB, rLipL32 e rLTB::LipL32 foram produzidas em E. coli, purificadas e caracterizadas. Hamsters fêmeas foram distribuídas em grupos e inoculadas com duas doses, da seguinte forma: rLTB; rLTB+rLipL32; rLTB::LipL32, bacterina homóloga e PBS. Soro foi coletado individualmente para determinação da resposta imune humoral por ELISA. Os animais foram desafiados com uma dose de 5×DL50 de Leptospira interrogans cepa Fiocruz L1-130. Os tratamentos induziram altos títulos de anticorpos anti-rLipL32. Os tratamentos rLTB+rLipL32 e rLTB::LipL32 induziram resposta protetora significativa frente ao desafio quando comparados com os grupos controle (p<0,05). Nenhum estudo anterior usou LTB como adjuvante para uma vacina contra leptospirose, tampouco antígenos fusionados com o intuito de controlar esta doença. Além disso, este é o primeiro relato de indução de imunidade protetora utilizando rLipL32 como vacina de subunidade, uma importante contribuição para o desenvolvimento de vacinas mais eficazes contra leptospirose.