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Publico-10788c.pdf: 1594628 bytes, checksum: fa7fab28f569affbc5aded02dd906e12 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Nosso principal objetivo foi caracterizar a família gp82 de proteínas, codificada pela família gênica gp82, que é parte da grande família multigênica gp85/trans-sialidase do T. cruzi. Até o início desse estudo, somente a gp82 de superfície, envolvida na invasão celular das formas metacíclicas da cepa CL e identificada pelo anticorpo monoclonal (MAb) 3F6, havia sido descrita. Na primeira parte, investigamos as bases da avirulência in vivo e in vitro das formas metacíclicas do clone CL-14 do T. cruzi , derivado da cepa CL. Descobrimos que a baixa infectividade desses parasitas está associada com a reduzida expressão da gp82 na superfície, reforçando o papel central da molécula na infecção pelo T. cruzi. Além disso, os dados sugeriram que devido à deficiência da gp82, as formas metacíclicas do clone CL-14, como as da cepa G, uti lizam preferencialmente as glicoproteínas gp35/50 para interagir com a célula hospedeira. Na segunda parte, analisamos a expressão e a localização de moléculas da família gp82 em formas metacíclicas das cepas G e CL do T. cruzi. Para isso, isolamos um novo membro (clone C03) que, em contraste com o clones de cDNA representantes da família gp82 previamente descritos, J18 (cepa G) e R31 (cepa CL), não contém o epítopo do MAb 3F6. Na análise comparativa da seqüência de aminoácidos do clone C03, observamos 59,1% de identidade com o clone J18 e 60,2% de identidade com o clone R31. Além disso, quando alinhamos as seqüências de aminoácidos dos clones C03 e Tc-85 (gp85 das formas tripomastigotas de cultura de tecido), observamos 57,2% de identidade, indicando que esse clone também é parte da família gp85/trans-sialidase. Utilizando os anticorpos policlonais anti-J18 e anti-C03, e o MAb 3F6, mostramos que membros da família gp82 são expressos em formas metacíclicas na superfície e intracelularmente, e que alguns desses membros têm localização diferenciada em parasitas dos grupos T. cruzi I e II. Ao contrário da gp82 reativa com o MAb 3F6, específica das formas metacíclicas, outras moléculas da família foram detectadas também nas formas tripomastigotas de cultura de tecido e amastigotas pelos anticorpos policlonais. Na terceira parte, investigamos o efeito da gp82 em sua forma recombinante (J18), sobre a linhagem de melanoma murino Tm5. Observamos que J18 liga-se a essas células induzindo a despolimerização dos filamentos de actina similar à citocalasina-D, droga indutora de apoptose em células de mamíferos. Em vista disso, fizemos uma análise comparativa das alterações no citoesqueleto de actina e eventos característicos de morte celular por apoptose nas células Tm5 tratadas com J18, e na linhagem de melanócitos melan-a, da qual Tm5 é derivada. Mostramos que J18 tem função indutora de apoptose somente sobre as células do melanoma Tm5. Descrevemos assim uma propriedade de um membro da família gp82, nunca antes descrita para nenhum outro componente molecularmente definido do T. cruzi. / The main goal of this work was to characterize the proteins encoded by the gp82 gene fami ly, which is part of the large T. cruzi gp85/trans-sialidase multigenic family. Previous studies had focused on the surface gp82, which is engaged in the cell invasion by CL strain metacyclic forms and is identified by monoclonal antibody (MAb) 3F6. Firstly, we investigated the molecular basis of the non-virulence of T. cruzi clone CL-14 metacyclic forms in vivo and in vitro. We found that the low infectivity of these parasites is associated with reduced expression of surface gp82, reinforcing the role of this molecule in T. cruzi infection. In addition, our data suggested that instead of gp82, metacyclic forms of clone CL-14, like G strain, preferentially engage gp35/50 glycoproteins to interact with the host cell. Secondly, we analyzed the expression and cellular localization of molecules of the gp82 family in T. cruzi metacyclic forms of G and CL strains. We cloned a new member of this family, designated C03, which lacks the MAb 3F6 epitope, in contrast to the previously described gp82 cDNA clones J18 (G strain) and R31 (CL strain). The predicted amino acid sequence of the C03 clone displayed 59,1% identity to J18 clone and 60,2% to R31 clone. When the amino acid sequences of C03 and Tc-85 (tissue culture trypomastigote gp85) clones were aligned, the identity was 57,2%, indicating that this new clone belongs to the gp85/trans-sialidase family. Using anti-J18 and anti-C03 polyclonal antibodies, as well as MAb 3F6, we demonstrated that members of the gp82 family are localized on the cell surface and intracellularly in metacyclic forms, and some members have different cellular localization in parasites from T. cruzi I and II groups. As opposed to metacyclic stage-specific gp82 identified by MAb 3F6, other gp82 fami ly molecules were also detected in tissue culture trypomastigotes and amastigotes by polyclonal antibodies. Thirdly, we investigated the effect of gp82, as a recombinant protein (J18), on the murine melanoma lineage Tm5. We observed that J18 binds to these cells disrupting actin filaments similarly to cytochalasin-D, drug that induces apoptosis in mammalian cells. Based on these information, we comparatively analyzed alterations in actin cytoskeleton and apoptotic events in J18-treated Tm5 cells, and in the melanocyte lineage melan-a, from which Tm5 is derived. J18 selectively induced apoptosis in Tm5 melanoma cells. Our results show an activity of a protein from gp82 family that has not been described for any other T. cruzi molecule. / TEDE
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9550 |
| Date | 28 May 2008 |
| Creators | Atayde, Vanessa [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Yoshida, Nobuko [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 121 f. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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