Na literatura encontram-se referências de estudos envolvendo micro-organismos endofíticos, e mais recentemente estudos que avaliam a interação entre micro-organismos o que resulta na modificação, no tipo ou quantidade dos compostos que são produzidos. Neste trabalho foram realizados cultivos simples e mistos do fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 e da actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7, endófiticos isolados de Lychnophora ericoides que pertencem à coleção do Laboratório de Química de Microorganismos (LQMo) da FCFRP-USP, com o objetivo de aumentar suas capacidades de produção de novos compostos com atividade biológica. O cultivo misto, ou co-cultivo, é uma estratégia que tem sido usada para o acesso aos produtos naturais de origem microbiana. Existem poucos relatos de compostos com atividade biológica isolados a partir de S. albospinus e não há relatos de metabólitos secundários obtidos a partir de C. boninense. Nenhum desses micro-organismos tem sido descrito como endofítico na literatura e não existem relatos sobre co-cultivos envolvendo qualquer um deles na busca de compostos bioativos. Juntando as informações geradas através das diferentes técnicas de detecção utilizadas, como TLC, HPLC-DAD, GC-MS, ESI-MS, RMN e depois da análise correspondente, foi possível identificar e atribuir as estruturas de algumas substâncias conhecidas de origem microbiana como a mevalonolactona, o tirosol, a fisostigmina, a desferrioxamina E. ESI-MS foi utilizada para análises dos extratos brutos originados dos cultivos em meio arroz parbolizado permitindo visualizar compostos produzidos em baixas quantidades pelos micro-organismos na cultura simples quanto na co-cultura. Além disso, foram obtidos os perfis metabólicos desses micro-organismos a partir de cultivos em placa de Petri, possibilitando a detecção dos metabólitos em regiões específicas da interação microbiana, o que conduziu à identificação da fisostigmina e o seu análogo N-etilcarbamato produzidos pela actinobactéria, na interação com o fungo. Análises posteriores de MS sequencial permitiram obter perfis de fragmentação, os quais, juntamente com os dados dos íons detectados nos extratos, foram comparados com a informação disponível em bases de dados como DNP, METLIN e MassBank. Tais informações geradas a partir dessas análises permitiram sugerir possíveis compostos envolvidos na interação dos micro-organismos endofíticos mencionados. Foi sugerido que a fisostigmina, substância produzida pela actinobactéria S. albospinus RLe 7 e isolada nesse trabalho, poderia ter algum papel na inibição do crescimento do fungo C. boninense FLe 8.1 já que a inibição só foi observada quando cultivados ambos os micro-organismos na mesma placa de Petri. Porém, bioensaios com fisostigmina pura demonstraram que essa substância não possui atividade antifúngica per se, mas é possível que exista uma sinergia com outras substancias produzidas pela actinobactéria. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstram a importância do uso de técnicas de detecção muito sensíveis, como a ESI-MS, na identificação de substâncias envolvidas na troca metabólica e permitiram gerar informações que serão utilizadas em estudos futuros utilizando esses micro-organismos endofíticos. / There are several studies involving endophytic microorganisms, and more recently some studies evaluate microbial interaction resulting in metabolic profiles modifications. In this study, simple and mixed cultures of the fungus Colletotrichum boninense FLe 8.1 and the actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7 were carried out. These endophytic microorganisms, isolated from Lychnophora ericoides, belong to the collection of the Laboratory of Microbial Chemistry (LQMo) of the FCFRP-USP. The main goal of this work was to increase the bioactive compounds production capacities. Co-culture, or mixed culture, is a recent strategy for accessing microbial natural products. There are few reports of bioactive metabolites from S. albospinus RLe 7 and there are no one about secondary metabolites obtained from C. boninense FLe 8.1. Neither the actinobacteria nor the fungus have been described as endophytic microorganisms and there are no co-culture studies involving these microorganisms in order to obtain natural products. Joining and analyzing all together the generated information from several detection techniques, such as TLC, HPLCDAD, GC-MS, ESI-MS, NMR, it was possible to identify and attribute the chemical structures of some known natural, such as mevalonolactone, tyrosol, physostigmine and deferrioxamine E. ESI-MS was used for extracts analysis from cultures in parboiled rice medium, allowing visualization of compounds produced in very low yields. Besides that, it was possible to obtain metabolic profiles from cultures in Petri dishes, leading to the detection of metabolites in specific regions of the microbial interaction. Physostigmine and its N-ethylcarbamate analogue were identified as actinobacteria metabolites in the interaction against the fungus. Posterior analysis by MS/MS allowed to obtain fragmentation profiles, which together with the ions detected from the extracts analysis, were compared by searching in databases, such as DNP, METLIN and MassBank. Such information allowed to suggest possible candidates for the compounds involved in the microbial metabolic exchange. It was hypothesized that physostigmine, isolated from the actinobacteria in this work, had a role in the fungal growth inhibition observed when both microorganisms were co-cultured. However, this substance did not show considerable antifungal activity when tested against C. boninense FLe 8.1, but it is possible that other compounds produced by this actinobacteria are acting in a synergistic way. The results showed here demonstrated the importance of very sensitive techniques, as ESI-MS, in the identification of molecules involved in the microbial metabolic exchange and will help in the generation of information for future studies involving those endophytic microorganisms.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24062013-141903 |
| Date | 22 February 2013 |
| Creators | Rodriguez, Andrés Mauricio Caraballo |
| Contributors | Pupo, Monica Tallarico |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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