A cultura de cana-de-açúcar ocupa posição de destaque nos cenários nacional e internacional devido principalmente a produção de etanol como fonte de energia renovável e menos nociva ao ambiente. Entretanto um dos obstáculos à produtividade é a ocorrência de várias doenças dentre elas a escaldadura das folhas causada por Xanthomonas albilineans. Bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia tem sido isoladas com alta frequência em diferentes culturas como, por exemplo, a cana-de-açúcar. Nas últimas décadas, estas bactérias têm recebido especial atenção devido ao seu potencial como promotoras de crescimento vegetal, como agentes de biorremediação, mas muito pouco é explorado quanto ao potencial biotecnológico dessas bactérias como agentes de biocontrole de doenças. Visto que essas bactérias vivem em um ambiente altamente competitivo e sujeito a flutuações ambientais, representam uma fonte altamente significativa de metabólitos secundários bioativos, como as bacteriocinas sintetizadas ribossomicamente e outros peptídeos não ribossomais. Portanto, os objetivos principais deste trabalho foram determinar a frequência de linhagens de Burkholderia spp. endofíticas e da rizosfera de cana-deaçúcar capazes de produzir bacteriocinas e outros metabólitos secundários e por meio de mutagênese aleatória por transposon, identificar genes associados a produção desses metabólitos. Os resultados de caracterização permitiram concluir que as bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia avaliadas apresentaram grande potencial em produzir metabólitos com atividade antibacteriana in vitro; sendo capazes de controlar X. albilineans importante patógeno da cultura de cana-de-açúcar. Para uma das linhagens foi obtida uma biblioteca de mutantes, a qual foi parcialmente caracterizada quanto à alteração da atividade antibacteriana. Foram identificados doze mutantes que apresentaram perda da atividade antibacteriana. A análise das sequências flanqueadoras do transposon para os doze mutantes permitiu a identificação de genes associados a produção de bacteriocinas, a regulação da expressão gênica, a enzimas possivelmente associadas ao metabolismo secundário, ao metabolismo geral da célula e a proteínas hipotéticas. A identificação e clonagem de tais genes permitirão uma maior compreensão da produção desses compostos e futuras aplicações biotecnológicas. / The sugarcane crop has an important role in international and national scenery mainly because the ethanol production as a sustainable energy source and less harmful to the environment. However one of the obstacles to the productivity is the occurrence of several diseases among them leaf scald caused by Xanthomonas albilineans. Endophytic and rhizospheric bacteria that belong to the Burkholderia genus have been isolated in high frequency in different cultures, such as sugarcane. In the last decades, these bacteria have been receiving attention due their potential as plant growth promoters, bioremediation agents. However, the biotechnological potential of these bacteria as agents of diseases biocontrol is very poorly evaluated. Since these bacteria live in a highly competitive environment and subject to environmental fluctuations, they may represent a highly significant source of bioactive secondary metabolites, as ribosomal synthesized bacteriocins and other nonribosomal peptides. Therefore, the main aim of this work was to determine the frequency of bacteriocin and secondary metabolites production by endophytic and rhizospheric isolates of Burkholderia spp. from sugarcane. Also, the genes associated to synthesis of these metabolites were identified by random mutagenesis based on Tn5 transposon. The results showed that endophytic and rhizospheric Burkholderia spp. present in vitro potential to production of metabolites with antibacterial activity; being inhibited X. albilineans, an important pathogen of sugarcane crops. For one of the Burkholderia strain it was obtained a mutant library, which was partially characterized according to antibacterial activity. Twelve mutants that showed the loss of antibacterial activity were identified and further evaluated. Also, the analysis of the transposon flanking sequences for these mutants indicated that genes associated to the bacteriocin production, regulation of gene expression, enzymes possibly associated to the secondary metabolism, general metabolism of the cell and hypothetical proteins are related to loss of inhibition ability. The identification and cloning of such genes will allow a better understanding of the production of theses compounds and further biotechnological applications.

Os fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior de tecidos ou órgãos dos vegetais, sem causar danos aos seus hospedeiros. Dentre as inúmeras características desses microrganismos está o seu potencial biorremediador Este trabalho teve como objetivo a avaliação do potencial biorremediador do endófito Mucor sp. isolado de Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), verificando a tolerância e capacidade de absorção do metal pesado cádmio (Cd), os efeitos desse metal na morfologia celular e no sistema de defesa antioxidante do fungo, e também o comportamento da planta modelo Solanum lycopersicum cultivar Calabash Rouge, inoculada com o endófito na presença do metal cádmio. Os resultados apresentados indicaram que um fungo endofítico do gênero Mucor, isolado da macrófita aquática E. crassipes, oriunda de uma lagoa contaminada com metais pesados, apresentou resistência a altas concentrações do metal cádmio. Este fungo apresentou uma modificação na sua morfologia em altas concentrações do metal, além de possuir a capacidade de reter este metal, tanto no interior do seu citoplasma, quanto em sua parede celular, o que pode estar ligada a mecanismos de desintoxicação e sequestro de metais relacionados à formação de complexos Cd-GSH. O mesmo fungo também apresentou um aumento na relação GSH/GSSG nos tratamentos com o metal. Os resultados ainda demonstraram que o estresse causado pelo metal induziu a ativação de enzimas antioxidantes SOD, CAT e GR no isolado endofitico. Além disso, este endófito, quando inoculado em plantas de tomate (Solanum lycopersicum), aumentou a capacidade de absorção do metal na parte aérea desta planta, além de promover crescimento da mesma, nos tratamentos sem o metal, Desta forma o isolado endofítico (CM3) Mucor sp. mostrou um potencial biorremediador, podendo ser utilizado como ferramenta para diminuir os danos causados a saúde humana e ao meio ambiente pelos metais pesados, principalmente o metal cadmio, e também na promoção de crescimento de plantas / Endophytic fungi live in the interior of plant tissues or organs, without causing harm to their hosts. Among several interesting characteristics of these microorganisms, some of them present a good potential for bioremediation. This study aimed at assessing the bioremediation potential of endophytic fungus Mucor sp. isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), analyzing chemical absorption ability and fungal tolerance to the heavy metal cadmium (Cd), besides testing the effects of cadmium on the cell morphology, the antioxidant defense system of the fungus, and the behavior of model plant (Solanum lycopersicum) variety Calabash Rouge inoculated with a spore suspension of Mucor sp. in the presence of cadmium. The results indicated that the endophytic fungus isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) plant located in a lagoon contaminated with heavy metals showed resistance to high concentrations of cadmium. The isolated fungus was identified as Mucor sp. The morphology studies demonstrated the occurrence of modifications on the fungus when in high concentrations of the metal. Furthermore, it was possible to verify that the fungus has a capacity to retain metal, both in the cytoplasm and cell wall. This aspect can be linked to detoxification and sequestration mechanisms of metals related to formation of Cd-GSH complexes, since this fungus also presented increase of GSH/GSSG ratio in the treatments with metal. The results also demonstrated that the stress caused by cadmium induces the activation of antioxidant enzymes SOD, CAT and GR in Mucor sp.. Moreover, the inoculation of this fungus in tomato plants increased the biosorption capacity of the cadmium in aerial parts of the plant, besides promoting its growth in the treatments without the metal. Thus the endophytic isolate (CM3) Mucor sp. presented a promising potential as a bioremediator, which can be used as a tool for reducing the damage caused by heavy metals, especially cadmium, to human health and environment

Os fungos endofíticos são microrganismos que vivem no interior de tecidos ou órgãos dos vegetais, sem causar danos aos seus hospedeiros. Dentre as inúmeras características desses microrganismos está o seu potencial biorremediador Este trabalho teve como objetivo a avaliação do potencial biorremediador do endófito Mucor sp. isolado de Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), verificando a tolerância e capacidade de absorção do metal pesado cádmio (Cd), os efeitos desse metal na morfologia celular e no sistema de defesa antioxidante do fungo, e também o comportamento da planta modelo Solanum lycopersicum cultivar Calabash Rouge, inoculada com o endófito na presença do metal cádmio. Os resultados apresentados indicaram que um fungo endofítico do gênero Mucor, isolado da macrófita aquática E. crassipes, oriunda de uma lagoa contaminada com metais pesados, apresentou resistência a altas concentrações do metal cádmio. Este fungo apresentou uma modificação na sua morfologia em altas concentrações do metal, além de possuir a capacidade de reter este metal, tanto no interior do seu citoplasma, quanto em sua parede celular, o que pode estar ligada a mecanismos de desintoxicação e sequestro de metais relacionados à formação de complexos Cd-GSH. O mesmo fungo também apresentou um aumento na relação GSH/GSSG nos tratamentos com o metal. Os resultados ainda demonstraram que o estresse causado pelo metal induziu a ativação de enzimas antioxidantes SOD, CAT e GR no isolado endofitico. Além disso, este endófito, quando inoculado em plantas de tomate (Solanum lycopersicum), aumentou a capacidade de absorção do metal na parte aérea desta planta, além de promover crescimento da mesma, nos tratamentos sem o metal, Desta forma o isolado endofítico (CM3) Mucor sp. mostrou um potencial biorremediador, podendo ser utilizado como ferramenta para diminuir os danos causados a saúde humana e ao meio ambiente pelos metais pesados, principalmente o metal cadmio, e também na promoção de crescimento de plantas / Endophytic fungi live in the interior of plant tissues or organs, without causing harm to their hosts. Among several interesting characteristics of these microorganisms, some of them present a good potential for bioremediation. This study aimed at assessing the bioremediation potential of endophytic fungus Mucor sp. isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) (Pontederiaceae), analyzing chemical absorption ability and fungal tolerance to the heavy metal cadmium (Cd), besides testing the effects of cadmium on the cell morphology, the antioxidant defense system of the fungus, and the behavior of model plant (Solanum lycopersicum) variety Calabash Rouge inoculated with a spore suspension of Mucor sp. in the presence of cadmium. The results indicated that the endophytic fungus isolated from a Eichhornia crassipes (Mart.) plant located in a lagoon contaminated with heavy metals showed resistance to high concentrations of cadmium. The isolated fungus was identified as Mucor sp. The morphology studies demonstrated the occurrence of modifications on the fungus when in high concentrations of the metal. Furthermore, it was possible to verify that the fungus has a capacity to retain metal, both in the cytoplasm and cell wall. This aspect can be linked to detoxification and sequestration mechanisms of metals related to formation of Cd-GSH complexes, since this fungus also presented increase of GSH/GSSG ratio in the treatments with metal. The results also demonstrated that the stress caused by cadmium induces the activation of antioxidant enzymes SOD, CAT and GR in Mucor sp.. Moreover, the inoculation of this fungus in tomato plants increased the biosorption capacity of the cadmium in aerial parts of the plant, besides promoting its growth in the treatments without the metal. Thus the endophytic isolate (CM3) Mucor sp. presented a promising potential as a bioremediator, which can be used as a tool for reducing the damage caused by heavy metals, especially cadmium, to human health and environment

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6576.pdf: 2966508 bytes, checksum: 60d9666ae228bda42b9fc4a21dae76c6 (MD5) Previous issue date: 2014-11-28 / Universidade Federal de Sao Carlos / Microorganisms, such as those belonging to the groups of Penicillium, Bacillus, Paenibacillus, represent represent an important source for the production of bioactive metabolites with varied applications. The production of these substances is directly related to the culture media, as well as the available carbon and nitrogen sources, conditions of pH, temperature and agitation (gas exchange). Among the microbial groups most studied about the production of various interest metabolites are the fungi and bacteria that inhabit the interior of plants, the endophytics. Thus, the present study aimed to isolate and identify endophytics microorganisms from leaves of four species of Tabebuia spp. and Hymenaea courbaril and study the production of interest metabolites by the lineages found. The microbial activities were studied: antibiotic capability against Gram positive and Gram negative bacteria, antifungal, antibiotic resistance, enzyme production, antitumor activity and pigment production. Microorganisms that stood out due to production of antibiotics, cytotoxicity against tumor cells and pigment production. This study selected microorganisms based on their most relevant production, in this case, it was the antibiotics production, pigments production and cytotoxicity, they were cultured in larger scale aiming at the improvement of the production of metabolite chosen according to the results. The selected microorganisms were a bacterium identified as Paenibacillus terrae and a fungus identified as Penicillium minioluteum/Talaromyces minioluteus complex. The P. terrae proved producing bioactive metabolites against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans, in addition to novel cytotoxic activity against HTC, and OVCAR8 SF295 tumor cells. This bacterium also showed unprecedented anti-Leishimania activity, acting against the promastigote form of the parasite. The isolated fungus proved producing a red pigment, in large quantities without cytotoxic, antifungal or antibacterial activity, favoring its industrials applications. Both selected microorganisms demonstrated potential for biotechnological and industrial applications, suggesting the viability of promising continuity of the work performed. / Os microrganismos, como os pertencentes ao grupo dos Penicillium, Bacillus, Paenibacillus, representam uma fonte importante para produção de metabólitos bioativos com diversas aplicações. A produção destas substâncias está diretamente relacionada ao cultivo em meios de cultura assim como as fontes de carbono e nitrogênio disponíveis, condições de pH, temperatura e trocas gasosas. Dentre os grupos microbianos que mais se destacam nas pesquisas para produção de diversos metabólitos encontram-se os fungos e bactérias que habitam o interior de plantas, os microrganismos endofíticos. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo isolar e identificar microrganismos endofíticos do cerrado a partir de folhas de quatro espécies de Tabebuia spp. e um exemplar de Hymenaea courbaril e estudar a produção de metabólitos de interesse biotecnológico das linhagens encontradas. As atividades microbianas estudadas foram: capacidade antibiótica contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, atividade antifúngica, resistência a antibióticos, produção enzimática, atividade antitumoral e produção de pigmentos. Os microrganismos que se destacaram devido a produção de antibióticos, citotoxicidade contra células tumorais e produção de pigmentos foram selecionados e cultivadas em maior escala objetivando o melhoramento da produção do metabólito escolhido por testes bioguiados. Selecionou-se Paenibacillus terrae e Penicillium complexo minioluteum/Talaromyces complexo minioluteus. O P. terrae mostrou-se produtor de metabólitos bioativos contra bactérias Gram positivas, Gram negativas e fungos leveduriformes, além da inédita atividade citotóxica contra células HTC, SF295 e OVCAR8. Esta bactéria apresentou também inédita atividade anti-Leishimania, atuando contra a forma promastigota do parasita. O fungo produziu pigmento de coloração vermelha em grande quantidade e foi selecionado devido à ausência de atividade citotóxica, antifúngica e antibacteriana. Ambos microrganismos selecionados demonstraram potencial de aplicações biotecnológicas e industriais, sugerindo a viabilidade promissora da continuidade dos trabalhos desenvolvidos.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3694.pdf: 1040825 bytes, checksum: 07255db3fd1638e75419879ee51ac8ab (MD5) Previous issue date: 2009-09-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Endophytic microorganisms lives in symbiotic association with plants and in one unique biological niche, and they are potential producers of natural bioactive substances with different chemical structure and biological activity. This study aimed to isolate and characterize endophytic microorganisms from Miconia albicans from Cerrado of São Carlos - SP. Samples were characterized phenotypically from typical features of colony morphology and macroscopic measurements, physiological, biochemical and morphodyeing and genotypically by 16S rRNA analysis. We evaluated the antagonistic potential of the isolates against Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis IAL 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 and Candida albicans ATCC 10231. Two samples (1 and 3) showed bioactivity against E. faecalis, with inhibition halos of 1.30 and 1.90 cm in diameter, respectively. A single sample (2) showed activity against S. marcensis (3.60 cm) with no significant bioactivity against the other microorganisms tested. In one sample (4) showed activity against four of the six microorganisms tested: E. faecalis (3,15 cm) , S. aureus (3,50 cm), C. albicans (3,35 cm) e S. sonnei (3,20 cm). In another sample (6) was detected bioactivity against E. faecalis and S. aureus, with inhibition zones of 1.80 and 1.50 cm, respectively. One of the samples (8) showed bioactivity against the greatest number of indicator microorganisms with inhibitory halos of 2.60 cm against E. faecalis, 1.50 cm against S. aureus, 2.40 cm against C. albicans, 2.10 cm against E. coli and 2.50 cm against S. sonnei. In two samples (5 and 7) there was no evidence the bioactive ability against indicator microorganisms tested. Phenotypic analysis of 8 endophytic microorganisms isolated allowed us to classify 50% of these (samples 4, 6, 7 and 8) in the Actinomyces group and the others were classified in the genus Streptomyces (samples 1, 2, 3 and 5). In the genotypic analysis of two isolates with bioactivity were identified as Nocardiopsis Dassonville (sample 3) and Amycolatopsis orientalis (sample 8), reporting for the first time his association with endophytic aerial parts of Miconia albicans from Cerrado of São Carlos, SP. / Microrganismos endofíticos vivem em associação simbiótica com plantas e habitam nichos biológicos únicos, além de serem potenciais produtores de substâncias naturais bioativas com estrutura química e atividade biológica diversas. Este trabalho objetivou isolar e caracterizar microrganismos endofíticos a partir de Miconia albicans do Cerrado de São Carlos SP. Amostras foram caracterizadas fenotipicamente a partir de tipicidade de morfologia colonial e determinações macroscópicas, fisiológicas, bioquímicas e morfo-tintoriais e genotipicamente através de análises de RNAr 16S. Foi avaliado o potencial antagônico dos isolados contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis IAL 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 e Candida albicans ATCC 10231. Duas amostras (1 e 3) apresentaram bioatividade contra E. faecalis, com halos de inibição de 1,30 e 1,90 cm de diâmetro, respectivamente. Uma única amostra (2) apresentou atividade contra S. marcensis (3,60 cm), não apresentando bioatividade contra os demais microrganismos testados. Em uma amostra (4) observou-se atividade contra quatro dos seis microrganismos testados: E. faecalis (3,15 cm) , S. aureus (3,50 cm), C. albicans (3,35 cm) e S. sonnei (3,20 cm). Em outra amostra (6) detectou-se bioatividade contra E. faecalis e S. aureus, com halos de inibição de 1,80 e 1,50 cm, respectivamente. Uma das amostras (8) apresentou bioatividade contra o maior número de microrganismos indicadores, com halos inibitórios de 2,60 cm contra E. faecalis, 1,50 cm contra S. aureus, 2,40 cm contra C. albicans, 2,10 cm contra E. coli e 2,50 cm contra S. sonnei. Em duas amostras (5 e 7) não foi evidenciada habilidade bioativa contra os microrganismos indicadores testados. Análises fenotípicas dos 8 microrganismos endofíticos isolados permitiram classificar 50% destes (amostras 4, 6, 7 e 8) no grupo Actinomyces e os outros foram classificados no gênero Streptomyces (amostras 1, 2, 3 e 5). Na análise genotípica dois dos isolados apresentando bioatividade foram caracterizados como Nocardiopsis dassonvillei (amostra 3) e Amycolatopsis orientalis (amostra 8), relatando pela primeira vez sua associação endofitica com partes aéreas de Miconia albicans do Cerrado de São Carlos, SP.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Natalia Carvalhaes de Oliveira.pdf: 1211975 bytes, checksum: 414976b584307f085c0610f71d63bb94 (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / Endophytic microorganisms live inside plants showing no apparently damage for the host, often assisting in survival of plants, helping its growth with production of phytohormones, phosphates solubilization, nitrogen fixation and enzymes production, or they can metabolize organic contaminants, like petroleum and derivates. This work aimed to isolated and identified endophytic microorganisms of plants present in impacted areas, as well as test their ability in petroleum and its derivatives degradation, identify bacteriocin production, to test their nitrogen fixation capability, phosphate solubilization, indol-acetic acid (IAA) and enzymes production. Plant samples were collected, in an area impacted with asphaltic and mud, were superficially disinfected using 70% ethanol, sodium hypochlorite and sterile distilled water. After macerated and fragmented, the samples were incubated at 30°C for about 72 hours, when growth of microorganisms was observed in culture media: Nutrient Agar, TSA (Tryptone Soya Agar) and King medium. The verification of petroleum and derivatives degradation capacity was performed in ELISA plates, exposing the bacteria to a solution of Minimal Medium, the dye DCPIP solution (2,6-dicloroindofenol sodium salt) and petroleum or derivative tested (burning oil, lubricating oil, diesel oil and gasoline). A positive reading for degradation was observed by discoloration of DCPIP. Among nine bacteria tested, three showed degradative activity in different fractions of petroleum, diesel oil and gasoline, and others showed different profiles. This result shows the potential of these microorganisms for application in bioremediation processes. The production of IAA was tested on TSA medium supplemented with tryptophan and only one sample was positive, while none was considered phosphate solubilizing. Testing the nitrogen fixing, samples were inoculated for a free nitrogen culture media, showing growth after 24 hours of incubation (positive results), however it s isolated did not show positive results in the acetylene reduction test, which confirms activity of the enzyme nitrogenase. The samples showed different profiles for the production and activity of bacteriocins against the clinical isolates tested. There were no detected activity of endoglucanase, cellulolytic and pectinolytic enzymes, but esterases, ß-glucosidases, proteases and amylases were positive. Some isolates were identified from the sequencing of 16S DNA, whose sequence was compared to database (GenBank), and then diagnosed as Bacillus cereus, Staphylococcus pasteuri and Pseudomonas sp. The endophytic bacteria isolated from Cerrado plants confirmed their potential for use in bioremediation, plant growth promotion and diverse enzyme production, with potential for use in pharmaceutical, food, textiles, among others. / Microrganismos endofíticos vivem no interior de plantas sem causar danos aparentes no hospedeiro, muitas vezes auxiliando na sobrevivência do vegetal, auxiliando seu crescimento com produção de fitormônios, solubilização de fosfatos, fixação de nitrogênio e produção de enzimas, ou metabolizando alguns compostos contaminantes orgânicos, como petróleo e/ou derivados. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar microrganismos endofíticos de vegetais presentes em áreas impactadas, assim como testar sua capacidade de degradação de petróleo e alguns derivados, identificar seu perfil para a produção de bacteriocinas, capacidade de fixação de nitrogênio, solubilização de fosfatos, produção de ácido indol-acético (AIA) e enzimas. Amostras vegetais foram coletadas em uma área impactada com lama asfáltica e desinfectadas superficialmente utilizando etanol 70%, hipoclorito de sódio e água destilada esterilizada. Depois de fragmentadas e maceradas, as amostras foram incubadas à 30o C por cerca de 72 horas, quando se observou crescimento de microrganismos nos meios de cultura: Agar nutriente, meio TSA (Tryptone Soya Agar) e meio de King. A verificação da capacidade de degradação de petróleo e derivados foi realizada em placas de ELISA, expondo a bactéria a uma solução contendo meio de cultura Mínimo, solução do corante DCPIP (sal de sódio de 2,6-dicloroindofenol) e petróleo ou derivado testado (óleo queimado, óleo lubrificante, óleo diesel e gasolina). A leitura positiva para degradação foi observada pela descoloração do DCPIP. Entre nove bactérias testadas, três apresentaram atividade degradativa em diferentes frações de petróleo, óleo diesel e gasolina, e as demais apresentaram variados perfis. Este resultado mostra a potencialidade desses microrganismos para aplicação em processos de biorremediação. A produção de AIA foi testada em meio TSA acrescido com triptofano e somente uma amostra apresentou resultado positivo, enquanto nenhuma foi considerada solubilizadora de fosfatos. Para teste de fixação de nitrogênio os isolados foram inoculados em meios livres de nitrogênio, apresentando crescimento após 24 horas de incubação, no entanto não apresentaram resultados positivos no teste de redução do acetileno, que confirma atividade da enzima nitrogenase. As amostras apresentaram variados perfis para a produção e atuação das bacteriocinas frente aos isolados clínicos testados. Não foi detectada atividade das enzimas endoglucanase, celulolítica e pectinolítica, mas sim de esterases, ß- glucosidases, proteases e amilases. Alguns isolados foram identificados a partir do sequenciamento da região 16S DNA, cuja sequência foi comparada a um banco de dados (GenBank) e então diagnosticados como Bacillus cereus, Staphylococcus pasteuri e Pseudomonas sp. Foi confirmada a caracterização de bactérias endofíticas isoladas de plantas de Cerrado com potencial para utilização em biorremediação, promoção de crescimento vegetal e diversa produção enzimática, com potencialidades para utilização em indústria farmacêutica, alimentícia, têxtil, entre outras.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriana.pdf: 2128343 bytes, checksum: a126c0f543395afa8dcd9b4112191c0f (MD5) Previous issue date: 2012-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Among the species of known insects (approximately 900 thousands), at about 2% is considered eusocial, because they live in truly advanced societies. The leaf-cutting ants belong to eusocial insects group and reached the major level of the instinct through the cultivation of fungi. Nowadays, they seems to be the unique animal group that have developed an advanced agriculture, based on their symbiosis with fungi, that appeared at about 50 million years ago, long before human being had appeared and become cultivator. Cutting leaves that serves as substrate to fungi cultivation for feed, ensure a high economic value to leaf-cutting ants, especially when they compete with men. So, the aim of this work was to perform a study about the microorganisms communities associated to the fungi garden of the leaf-cutting ants, Atta sexdens, evaluating the possibility to control them by the antagonistic activity of endophyte microorganisms from Amazon plants. To enable these assays, 13 leaf-cutting ants colonies (at about 5 monts of age) containing all classes (queen, soldiers, males and workers) were collected and transferred to the Laboratório de Microrganismos LABGEMMA of the Universidade Federal do Amazonas UFAM. From these anthill, associated microorganisms were isolated, cultivated, identified (by molecular and classical methods) and preserved at appropriated conditions. The antagonisms assays were performed by the method of paired culture, using endophytic microorganisms as inhibitors of those anthill associated. In vivo assays were performed with lab assembled anthills, to evaluate the potential for biological control against them. The main isolated and identified anthills associated microorganisms were: Leucoagaricus gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus flavus; Trichoderma longibrachiatum; Fusarium solani, yeasts and gram positive and gram negative bacteria. Antagonisms assays against L. gongylophorus, T. longibrachiatum, A. flavus and one of the anthill yeasts were promissing as an alternative method to the anthills biological control. / Calcula-se que entre as espécies de insetos conhecidas (cerca de 900 mil), próximo de 2% são ditas eussociais, pois vivem em sociedades verdadeiramente avançadas. As formigas cortadeiras estão inseridas no grupo dos insetos eussociais e atingiram o que pode se chamar de apogeu do instinto por meio da agricultura de fungos. Até o momento, parece ser o único grupo de animais, além do homem, que desenvolveu uma agricultura avançada, que se baseia na simbiose mutualística com os fungos e surgiu há mais de 50 milhões de anos, ou seja, muito antes de o homem existir e se tornar agricultor. O fato de esses insetos cortarem folhas que servem de substrato para o cultivo do fungo do qual se alimentam as torna de grande importância econômica, sobretudo quando competem conosco. Dentro desse contexto, objetivou-se realizar um estudo sobre a microbiota associada ao jardim de fungos das formigas cortadeiras Atta sexdens, avaliando-se a possibilidade de controlá-los por meio da atividade antagonista de microrganismos endofíticos provenientes de plantas da Amazônia. Para viabilizar esses ensaios foram coletadas, em campo, treze colônias de formigas com aproximadamente cinco meses contendo todas as castas (rainha, soldados, machos e operárias) e encaminhado ao Laboratório de Microrganismos LABGEMMA da Universidade Federal do Amazonas UFAM. A partir desses formigueiros, os microrganismos associados foram isolados, cultivados, identificados (por métodos clássicos e moleculares), e preservados em meios e condições apropriadas. Os ensaios de antagonismo foram realizados pelo método de cultivos paralelos, in vitro , utilizando-se microrganismos endofíticos como agentes inibidores dos microrganismos associados aos formigueiros. Foram realizados ainda ensaios in vivo , utilizando-se formigueiros montados em laboratório, para avaliar o potencial dos endófitos no controle biológico dos formigueiros. Os principais microrganismos isolados e identificados como associados aos formigueiros foram: Leucoagaricus gongylophorus; Bionectria ochroleuca; Aspergillus flavus; Trichoderma longibrachiatum; Fusarium solani, leveduras e bactérias gram negativas e positivas. Os ensaios de antagonismo contra L. gongylophorus, T. longibrachiatum, A. flavus e contra uma das leveduras do formigueiro, foram promissores como métodos alternativos para o controle biológico dos formigueiros.

A cultura de cana-de-açúcar ocupa posição de destaque nos cenários nacional e internacional devido principalmente a produção de etanol como fonte de energia renovável e menos nociva ao ambiente. Entretanto um dos obstáculos à produtividade é a ocorrência de várias doenças dentre elas a escaldadura das folhas causada por Xanthomonas albilineans. Bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia tem sido isoladas com alta frequência em diferentes culturas como, por exemplo, a cana-de-açúcar. Nas últimas décadas, estas bactérias têm recebido especial atenção devido ao seu potencial como promotoras de crescimento vegetal, como agentes de biorremediação, mas muito pouco é explorado quanto ao potencial biotecnológico dessas bactérias como agentes de biocontrole de doenças. Visto que essas bactérias vivem em um ambiente altamente competitivo e sujeito a flutuações ambientais, representam uma fonte altamente significativa de metabólitos secundários bioativos, como as bacteriocinas sintetizadas ribossomicamente e outros peptídeos não ribossomais. Portanto, os objetivos principais deste trabalho foram determinar a frequência de linhagens de Burkholderia spp. endofíticas e da rizosfera de cana-deaçúcar capazes de produzir bacteriocinas e outros metabólitos secundários e por meio de mutagênese aleatória por transposon, identificar genes associados a produção desses metabólitos. Os resultados de caracterização permitiram concluir que as bactérias endofíticas e rizosféricas pertencentes ao gênero Burkholderia avaliadas apresentaram grande potencial em produzir metabólitos com atividade antibacteriana in vitro; sendo capazes de controlar X. albilineans importante patógeno da cultura de cana-de-açúcar. Para uma das linhagens foi obtida uma biblioteca de mutantes, a qual foi parcialmente caracterizada quanto à alteração da atividade antibacteriana. Foram identificados doze mutantes que apresentaram perda da atividade antibacteriana. A análise das sequências flanqueadoras do transposon para os doze mutantes permitiu a identificação de genes associados a produção de bacteriocinas, a regulação da expressão gênica, a enzimas possivelmente associadas ao metabolismo secundário, ao metabolismo geral da célula e a proteínas hipotéticas. A identificação e clonagem de tais genes permitirão uma maior compreensão da produção desses compostos e futuras aplicações biotecnológicas. / The sugarcane crop has an important role in international and national scenery mainly because the ethanol production as a sustainable energy source and less harmful to the environment. However one of the obstacles to the productivity is the occurrence of several diseases among them leaf scald caused by Xanthomonas albilineans. Endophytic and rhizospheric bacteria that belong to the Burkholderia genus have been isolated in high frequency in different cultures, such as sugarcane. In the last decades, these bacteria have been receiving attention due their potential as plant growth promoters, bioremediation agents. However, the biotechnological potential of these bacteria as agents of diseases biocontrol is very poorly evaluated. Since these bacteria live in a highly competitive environment and subject to environmental fluctuations, they may represent a highly significant source of bioactive secondary metabolites, as ribosomal synthesized bacteriocins and other nonribosomal peptides. Therefore, the main aim of this work was to determine the frequency of bacteriocin and secondary metabolites production by endophytic and rhizospheric isolates of Burkholderia spp. from sugarcane. Also, the genes associated to synthesis of these metabolites were identified by random mutagenesis based on Tn5 transposon. The results showed that endophytic and rhizospheric Burkholderia spp. present in vitro potential to production of metabolites with antibacterial activity; being inhibited X. albilineans, an important pathogen of sugarcane crops. For one of the Burkholderia strain it was obtained a mutant library, which was partially characterized according to antibacterial activity. Twelve mutants that showed the loss of antibacterial activity were identified and further evaluated. Also, the analysis of the transposon flanking sequences for these mutants indicated that genes associated to the bacteriocin production, regulation of gene expression, enzymes possibly associated to the secondary metabolism, general metabolism of the cell and hypothetical proteins are related to loss of inhibition ability. The identification and cloning of such genes will allow a better understanding of the production of theses compounds and further biotechnological applications.

A diversidade da comunidade endofítica de fungos associada à cana-de-açúcar transgênica tolerante a imazapyr e suas linhas de cultivo não transgênicas foi avaliada por isolamento e ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis). Cultivares transgênicos e não-transgênicos, e seu manejo (aplicação do herbicida ou remoção manual de daninhas), foram considerados para verificar o possível efeito indireto da cana-deaçúcar geneticamente modificada (GM) sobre a comunidade de fungos endofíticos. O total de quatorze haplótipos de ARDRA foram observados na comunidade endofítica de cana-de-açúcar. O seqüenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 revelou uma comunidade rica representada por doze famílias diferentes do filo Ascomicota. Alguns dos isolados demonstraram alta similaridade com gêneros que ocorrem comumente como endófitos em plantas de clima tropical, como Cladosporium, Eppicoccum, Fusarium, Guignardia, Pestalotiopsis e Xylaria. A análise de variância molecular (AMOVA) indicou que as flutuações observadas na composição dos haplótipos estão relacionadas tanto ao cultivar transgênico quanto a aplicação do herbicida. Enquanto a aplicação do herbicida induziu mudanças rápidas e transientes na comunidade de fungos, as plantas transgênicas induziram mudanças mais lentas que foram mantidas ao longo do tempo. Uma abordagem independente de cultivo baseada em bibliotecas de 18S ambiental revelou a presença de clones com seqüências similares a gêneros das famílias Ustilaginaceae e Filobasidiaceae, e das ordens Sporidiobolales e Tremellales, todos do filo Basidiomicota. Os resultados aqui demonstrados representam o primeiro relato sobre a composição de fungos endofíticos associados a plantas de cana-de-açúcar e também representam um passo importante para o entendimento dos efeitos que plantas transgênicas e seu manejo podem induzir sobre a comunidade de fungos endofíticos. / The diversity of fungal endophytic community associated with transgenic imazapyr-tolerant sugarcane plants and its non-transgenic lines was evaluated by isolation and ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis). Transgenic and nontransgenic cultivars and their crop management (herbicide application or manual weed control) were considered in order to assess the possible non-target effects of genetically modified (GM) sugarcane on the fungal endophytic community. A total of fourteen ARDRA haplotypes were observed in the endophytic community of sugarcane. ITS1- 5.8S-ITS2 sequencing revealed a rich community represented by twelve different families from the Ascomycota phylum. Some of the isolates showed a high sequence similarity with genera that commonly occur as endophytes in plants from tropical climates, such as Cladosporium, Eppicoccum, Fusarium, Guignardia, Pestalotiopsis and Xylaria. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) indicated that fluctuations observed in haplotypes composition were related to both transgenic cultivar and herbicide application. While herbicide applications induced quickly transient changes in the fungal community, transgenic plants induced slower changes that were maintained over time. A cultivation-independent approach based on libraries of environmental 18S revealed the presence of clones with high sequence similarity with genera from Ustilaginaceae and Filobasidiaceae families and Sporidiobolales and Tremellales orders, all from Basidiomycota phylum. The results demonstrated here represent the first draft on the composition of fungal endophytes associated with sugarcane plants and also represent an important step to understand the effects that transgenic plants and their crop management may induce on fungal endophytic community.

A diversidade da comunidade endofítica de fungos associada à cana-de-açúcar transgênica tolerante a imazapyr e suas linhas de cultivo não transgênicas foi avaliada por isolamento e ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis). Cultivares transgênicos e não-transgênicos, e seu manejo (aplicação do herbicida ou remoção manual de daninhas), foram considerados para verificar o possível efeito indireto da cana-deaçúcar geneticamente modificada (GM) sobre a comunidade de fungos endofíticos. O total de quatorze haplótipos de ARDRA foram observados na comunidade endofítica de cana-de-açúcar. O seqüenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2 revelou uma comunidade rica representada por doze famílias diferentes do filo Ascomicota. Alguns dos isolados demonstraram alta similaridade com gêneros que ocorrem comumente como endófitos em plantas de clima tropical, como Cladosporium, Eppicoccum, Fusarium, Guignardia, Pestalotiopsis e Xylaria. A análise de variância molecular (AMOVA) indicou que as flutuações observadas na composição dos haplótipos estão relacionadas tanto ao cultivar transgênico quanto a aplicação do herbicida. Enquanto a aplicação do herbicida induziu mudanças rápidas e transientes na comunidade de fungos, as plantas transgênicas induziram mudanças mais lentas que foram mantidas ao longo do tempo. Uma abordagem independente de cultivo baseada em bibliotecas de 18S ambiental revelou a presença de clones com seqüências similares a gêneros das famílias Ustilaginaceae e Filobasidiaceae, e das ordens Sporidiobolales e Tremellales, todos do filo Basidiomicota. Os resultados aqui demonstrados representam o primeiro relato sobre a composição de fungos endofíticos associados a plantas de cana-de-açúcar e também representam um passo importante para o entendimento dos efeitos que plantas transgênicas e seu manejo podem induzir sobre a comunidade de fungos endofíticos. / The diversity of fungal endophytic community associated with transgenic imazapyr-tolerant sugarcane plants and its non-transgenic lines was evaluated by isolation and ARDRA (Amplified rDNA Restriction Analysis). Transgenic and nontransgenic cultivars and their crop management (herbicide application or manual weed control) were considered in order to assess the possible non-target effects of genetically modified (GM) sugarcane on the fungal endophytic community. A total of fourteen ARDRA haplotypes were observed in the endophytic community of sugarcane. ITS1- 5.8S-ITS2 sequencing revealed a rich community represented by twelve different families from the Ascomycota phylum. Some of the isolates showed a high sequence similarity with genera that commonly occur as endophytes in plants from tropical climates, such as Cladosporium, Eppicoccum, Fusarium, Guignardia, Pestalotiopsis and Xylaria. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) indicated that fluctuations observed in haplotypes composition were related to both transgenic cultivar and herbicide application. While herbicide applications induced quickly transient changes in the fungal community, transgenic plants induced slower changes that were maintained over time. A cultivation-independent approach based on libraries of environmental 18S revealed the presence of clones with high sequence similarity with genera from Ustilaginaceae and Filobasidiaceae families and Sporidiobolales and Tremellales orders, all from Basidiomycota phylum. The results demonstrated here represent the first draft on the composition of fungal endophytes associated with sugarcane plants and also represent an important step to understand the effects that transgenic plants and their crop management may induce on fungal endophytic community.