Nous avons développé un module de detection de bactérie base sur le suivi électrochimique d’une PCR. Le système a été realisé en Copolymère d’Oléfin Cyclique (COC). Il s’agit ici de présenter une nouvelle approche pour concevoir des systèmes de despistage d’infection nosocomiale en quelques heures. INTRODUCTION Avec le développement des flux migratoires de population et l’apparition de résistance aux antibiotiques, les infections nosocomiales sont devenues un enjeu de santé majeur. Les besoins en systèmes de diagnostique accessibles financièrement augmentent considérablement. L’approche qui consiste à intégrer entièrement une chaîne d’analyse commence à avoir les faveurs des systèmes de santé et en particulier de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Une compagnie nord américaine Cepheid a par ailleurs déjà développé un système automatisé de détection de germes basé sur l’identification de l’ADN par PCR. Cependant le coût élevé des technologies ralentit sa démocratisation malgré un apport considérable pour les tests cliniques de routine. Ici nous nous proposons une stratégie d’analyse qui permet de maîtriser les drastiquement les coûts de consommable. Tout d’abord tout le système est réalisé en COC, un thermoplastique qui peut être façonné à très grande échelle pour quelques dizines de centimes l’unité. [1]. Ensuite le système de détection, implique un suivi électrochimique qui remplace avantageusement les plateformes optiques traditionnellement coûteuses. Si la première cible de ce système est le dépistage de maladie nosocomiale, il apparaît aussi qu’il est transposable à d’autres domaines où la détection basée sur une PCR peut apporter des solutions. THEORIE L’échantillon, un écouvillon nasal est prélevé sur le patient. Ensuite les bactéries sont lysées grâce à l’utilisation de détergent. Une fois les parois bactériennes détruites, l’ADN est extrait sur phase solide par l’intermédiaire de billes magnétiques de type « charge switch » assemblées en colonnes [2]. Après lavage l’ADN est élué, puis amplifié par PCR en temps réel. Durant cette phase l’amplification de l’ADN est suivie grâce à l’utilisation d’un intercalant redox. Ce principe de détection fait l’objet d’un brevet [3] et nous présentons ici sa première implémentation dans un système de type laboratoire sur puce. Le complexe redox qui sert d’intercalant est détecté par voltammétrie à onde carrée (en anglais : Square Wave Voltammetry SQWV). Ce complexe interagit avec l’ADN double brin par intercalation pendant la phase d’élongation, ainsi il n’est plus disponible pour l’échange d’électrons avec les électrodes de détection. En conséquence, on observe une chute du niveau de courant mesuré pendant la SQWV qui correspond à l’augmentation de la quantité d’ADN. PRATIQUE De noveaux protocoles de fabrication de systèmes en thermoplastique ont été développés permettant de réaliser des système en COC robustes et étanches. L’intégration des électrodes sérigraphiées a été réalisée avec succès. Le desgin de la puce a été choisi afin de permettre la parallélisation d’expérience en vue des tests de sensibilité de détection. Afin de réaliser les cycles de chauffage nécessaire à l’amplification par PCR un système dédié, comprenant un bloc thermique, un système de régulation et une partie logicielle à été développé. La preuve de concept de l’efficacité du système a été démontré sur de l’ADN modèle : le Litmus. Il est possible de distinguer différentes concentration en ADN de départ. / With the development of human mobility and antibiotics resistance, nosocomial infections have become a major health problem. The need for fast and efficient diagnosis systems, ,while affordable by the health care systems, is increasing. The “sample to result” integration allowed by microfludics is a strong asset in such developments. Cepheid developed an integrated system for germ genotyping based on real-time PCR, but due to expensive laser-induced fluorescence detection its cost still reduces its range of applications in routine clinics. Here, we propose a new strategy allowing further cost reduction. First, the whole analysis streamline is integrated in a single chip made of Cyclo Olefin Copolymer (COC) [1]. This material can be mass-processed by CD technology, to yield chips at a few cents a piece. Second, the detection involves an electrochemical method that alleviates need for optics. Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) was chosen as the initial primary target for validation. The technologies developed will further be applied to other strains of Bacteria or other fields such as agriculture, food testing, GMOs or security. The sample, a nasal swab, undergoes a chemical lysis, and DNA is extracted by selective capture on magnetic beads self-assembled into dense microcolumns arrays, as presented at MicroTAS 2009 [2]. DNA is then eluted, amplified by PCR in real time in the chip, while detected in situ by a high sensitivity electrochemical detection catalyzed by an intercalating redox compound. This proprietary technology [3] is being implemented here for the first time in a lab on chip. New protocols were developed to make a robust and leakage-free COC microfluidic chip with integrated electrodes. COC is a biocompatible and solvent resistant thermoplastic material. The COC microfluidic chip consists of a substrate with a hot-embossed microchannel and screen printed carbon and silver electrodes. The chip is sealed by solvent bonding [4]. This provides simple and cost effective fabrication, directly upscalable to mass production PCR Thermal control is done externally with a customized thermocycler. A redox compound is introduced together with DNA sample enabling electrochemical detection through Square Wave Voltammetry (SQWV). This compound intercalates in double-stranded DNA during the extension step, reducing its mobility and redox activity, so the peak current decreases during amplification of the target DNA. A sensitivity below 1ng/µL suitable for MRSA detection was achieved. The data were obtained by SQWV measurements. There is a clear correlation between the increase of DNA concentration and the decrease of the peak current for the redox compound: PCR amplification was also performed inside the chip, demonstrating the compatibility of this platform with thermal cycling and biomolecular reactions. Real-time electrochemical measurement during cycling was not possible yet due to experimental setup geometrical constraints, but work is in progress and results will be presented at the conference. Future experiments will focus on the integration of the bacteria lysis and DNA extraction steps on the same chip.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015PA066189 |
| Date | 16 January 2015 |
| Creators | Taniga, Velan |
| Contributors | Paris 6, Viovy, Jean-Louis, Descroix, Stéphanie, Malaquin, Laurent |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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