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Previous issue date: 2009-10-29 / One of the most important sanitary problems that cause economic losses in swine
industry is the diarrhea caused by Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). It is the
main infectious cause of mortality for animals in suckling and post-weaning periods.
Their primary factors of pathogenicity are the fimbriae, which bond the bacteria to
specific receptors of the enterocytes. This causes a succession of events, brought
about by the enterotoxins, the stable toxins (ST) and heat-labile toxins (LT), leading
to diarrhea. Another important structure is the flagellum, which has an important role
in cell stimulation to produce pro-inflammatory cytokines through the interaction with
Toll-like receptors (TLR5), signaling cell recruitment and activation, thus increasing
local inflammation as well as antigen presentation to lymphocytes. Quorum Sensing
is a signaling system among bacteria that uses substances denominated autoinducers
(AI). When the auto-inducers reach a certain concentration, due to an
increase of cell density, there is an activation of transcriptional factors, which regulate
the gene expression. The catecholamines (adrenaline and noradrenalin), produced
by nervous cells, use the auto-inducer type 3 (AI-3) pathway. These have a
significant role in gene expression as they stimulate the growth and the expression of
virulence factors of the Escherichia coli. The goal of the present study was to produce
experimental vaccines containing total cultures of ETEC cultivated in different
induction conditions, mediated by the conditioned media (mc) so as to study the
expression of vaccine antigens. Different concentrations of mc were used, with the
50% of conditioned media added with 500 μM of adrenaline having the major initial
growth and antigen expression. In the motility assay, a sixteen-fold increase was
observed in comparison to the control. By the ELISA, hemoagglutination,
hemoagglutination inhibition and Dot Blot techniques, a higher expression of fimbriae
(F4) was observed, whereas by Dot Blot, ELISA and RT-PCR techniques an increase
of LT expression was observed. Based on this data a bacterin was prepared using
50% of mc and 500 μM of adrenaline, with Al(OH)3 as an adjuvant. Five weeks old
Swiss female mice were vaccinated twice with 250 μL subcutaneously on days 0 and
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14. The vaccine immune response was evaluated by ELISA and hemoagglutination
inhibition. The mc bacterin vaccinated group respond with a seroconversion
significantly higher that the control group. These results suggest that the presence of
mc with adrenaline is capable of activating the expression of important vaccine
antigens, therefore making bacterin more efficient. / Um dos maiores problemas sanitários que causam prejuízo à suinocultura é a
diarréia causada por Escherichia coli Enterotoxigênica (ETEC). Esta é a causa
infecciosa mais comum de mortalidade em animais em aleitamento e no período
pós-desmame. Os fatores primários de patogenicidade desta bactéria são as
fímbrias, que as ancoram a receptores específicos dos enterócitos permitindo que as
enterotoxinas, toxinas termo estáveis (ST) e toxinas termo lábeis (LT) desencadeiem
uma sucessão de eventos levando à diarréia. Outra estrutura é o flagelo que possui
um papel na estimulação de células na produção de citocinas pró-inflamatórias
através da interação com receptores Toll-like 5 (TLR5), sinalizando o recrutamento e
ativação de células, desta forma ampliando a inflamação local bem como a
apresentação de antígeno aos linfócitos. Quorum Sensing é um sistema de
sinalização entre as bactérias, os quais produzem substâncias denominadas de
auto-indutores (AI). Quando os auto-indutores alcançam uma determinada
concentração, decorrente do aumento da densidade celular ocorre uma ativação de
fatores transcricionais que acabam regulando a expressão gênica. As catecolaminas
(adrenalina e noradrenalina), produzidas pelas células nervosas, utilizam a via de
sinalização do auto-indutor tipo 3 (AI-3) que têm um papel significante na expressão
gênica, estimulando o crescimento e a expressão de fatores de virulência de
Escherichia coli. O objetivo deste estudo foi utilizar o sistema de sinalização Quorum
Sensing para induzir a expressão in vitro de antígenos vacinais de Escherichia coli
Enterotoxigênica cultivadas em diferentes condições de indução mediada pelos
meios condicionados (mc). Diferentes concentrações de mc foram utilizadas, sendo
que o maior crescimento inicial e a maior expressão de antígenos de interesse foram
obtidos com 50% de meio condicionado adicionado de 500 μM de adrenalina. No
ensaio de motilidade foi observado um aumento de 16 vezes em relação ao controle.
Pelas técnicas de ELISA, hemaglutinação, inibição da hemaglutinaçõa e Dot blot foi
observado uma maior expressão de fimbria (F4) e pelas técnicas de Dot blot, ELISA
e RT-PCR foi observado aumento da expressão de LT. Baseado nesses dados
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testou-se uma bacterina utilizando 50% de mc e 500 μM de adrenalina com Al(OH)3
como adjuvante. Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas com 5 semanas de
idade que foram vacinados por via subcutânea com 250 μL nos dias 0 e 14. A
avaliação da resposta imune foi realizada através de soroconversão frente aos
antígenos estudados por meio de ELISA e inibição da hemaglutinação. O grupo
vacinado com a bacterina com mc obteve uma soroconversão significativamente
superior ao grupo controle. Estes resultados sugerem que a presença de mc com
adrenalina são capazes de ativar a expressão de importantes antígenos vacinais,
tornando desta forma a bacterina mais eficiente.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpel.edu.br:123456789/1272 |
| Date | 29 October 2009 |
| Creators | Sturbelle, Régis Tuchtenhagen |
| Contributors | CPF:20732660025, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763076J5, Dellagostin, Odir Antônio, CPF:42251850015, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4723107D9, Turnes, Carlos Gil, CPF:27798690034, http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783259J8, Leite, Fabio Pereira Leivas |
| Publisher | Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPel, BR, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPEL, instname:Universidade Federal de Pelotas, instacron:UFPEL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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