Orientador : Lucila Costallat Ricci / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-28T21:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2001 / Resumo: Cepas de Escherichia coZi podem apresentar mecanismos e fatores de virulência diversos podendo causar no homem, principalmente, infecções intestinais. Desta forma, tendo-se como base os dados clínicos, expressão de mecanismos e de fatores de virulência, dados epidemiológicos, sorotipagem e análises moleculares, dentre outros, as cepas de E. coZi diarreiogênicas humanas podem ser classificadas em pelo menos sete grupos de enteropatogenicidade. Com relação ao grupo diarreiogênico representado pela E. coZi enterotoxigênica (ETEC), a identificação destes patógenos incluem a pesquisa das enterotoxinas STa e/ou LT e a expressão de fatores de colonização (FC). Estes últimos, também denominados de adesinas, permitem a colonização da bactéria à mucosa do intestino delgado, podendo variar morfológica e antigenicamente. Vários FC já foram identificados e caracterizados em cepas ETEC isoladas de diferentes regiões geográficas. Em trabalhos anteriores, a runbria PCF02 foi identificada, caracterizada e purificada a partir de 2 cepas ETEC LT+ pertencentes ao sorogrupo 02, isoladas no nosso meio. Na seqüência dos trabalhos, a partir da fimbria purificada, 9 hibridomas secretores de anticorpos monoclonais reativos com PCF02 foram obtidos, seus isotipos determinados e soluções ascíticas dos mesmos preparadas e tituladas em provas de Western blotting e ELISA. Após a padronização da prova de Inibição do ELISA, desenvolvida com MAbs dos isotipos IgA (4) e IgG2b (5) e pools dos mesmos, mais 5 amostras diarreiogênicas de E. coZi foram identificadas como sendo PCFO2+. Possível homologia (analogia) de epítopos com CFAIII foi verificada com estes MAbs, através de observações em imunomicroscopia. Neste trabalho, dando continuidade aos estudos relacionados ao PCFO2, procurou-se inicialmente reavaliar-se a metodologia de purificação e comprovar-se a Prova de Inibição do ELISA padronizada para a identificação desta fimbria, além de verificar-se possíveis homologias de epítopos entre PCF02 e outros FC, descritos como os mais freqüentemente identificados em cepas ETEC isoladas de fezes humanas. Com base nos resultados obtidos, comprovou-se que MAbs do isotipo IgA reconhecem epítopos distintos dos MAbs IgG2b, uma vez que estes últimos são capazes de reagirem com uma segunda subunidade de 15 kDa de PCF02, em provas de Westem blotting. Esta nova subunidade desta fímbria talvez deva corresponder ao "tip" da mesma. Pelos experimentos desenvolvidos verificou-se que apenas as amostras 312-2 e 312-3, dentre as cinco cepas identificadas inicialmente como PCF02+, expressavam realmente esta fímbria apresentando, também, a fração de 15kDa. Quanto às amostras D242 e D243, estas demonstraram pertencer ao complexo CF AIIV expressando CS5 e CS6 sendo que esta última subunidade apresenta epítopos idênticos aos expressos em PCF02. Quanto às amostras pertencentes ao sorogrupo 02, nenhuma reação inespecífica foi verificada. Portanto, a Prova de Inibição do ELISA desenvolvida com MAbs do isotipo IgG2b demonstrou ser adequada não só para a identificação das duas subunidades de PCF02 expressas em cepas ETEC, como também de amostras ETEC do complexo CF AIIV, que sempre expressam a subunidade CS6 / Abstract: Some strains of Escherichia coZi may expresses differents mechanisms and virulences factors representing one of several highly adapted clones wich together have evolved the ability to cause a broad spectrum of human and animal diseases. With respect to enteric diarrheal diseases caused by E. coZi strains, seven categories of diarrheagenic E. coZi isolated from human stool cultures have been classified, based on clinical observations, mechanisms, virulence factors, epidemiologic studies, serotypes and molecular analysis. The group represented by enterotoxigenic E. coZi (ETEC) is identified by ST and or L T enterotoxins production and expression of colonization factors (CF). These adhesins allow bacteria colonization on the surface of the small bowel mucosa. Detection of CF in alI ETEC strains identified in the differents geographic regions of the world is impractical because of their great number and heterogeneity. Previous studies, a new putative colonization factor (PCF) was characterized in isolates of ETEC from human diarrheical stools at Ouro Preto (MG) Brazil, expressing just L T and belonging to sorogroup 02. This fimbriae was named PCF02, and with this purified antigen nine hybridomas secreting MAbs (monoclonal antibodies) against PCF02 were produced. For standardization of Inhibition ELISA Test to identify PCF02 in enterotoxigenics strains pools of these MAbs, belonging to isotypes 19A (4) and IgG2b (5), were tested using this immune reaction. After testes new five ETEC strains presented positive results to PCF02, alI belonging to serogroup 02. The aim of this study included improvement of the purification methods of this fimbriae and evidences confirming sensibility and specificity of Inhibition ELISA Test in PCF02 identification. The objectives propossed also included study of possible epitopes similarity between this fimbriae and the most frequently CF reported in epidemiological studies. Ours results confumed that Mabs belonging to 19A and IgG2b isotypes reacted with differents epitopes of PCFO2. With respect to IgG2b a new subunit or adhesin presenting about 15 kDa was identified in Westem blotting reactions in semi-purified proteic extraction of PCFO2 strain. Regarding to Inhibition ELISA Test developed with MAbs belonging to both isotypes datas confirmed expression of PCFO2 just by 312-2 and 312-3 isolates. Antigenic similarities was demonstrated between CS6 belonging to CF AIIV complex and PCFO2. Results demonstrated that D242 and D243 expresse CS5 and CS6. We conclude that the Inhibition ELISA Test developed with MAbs of isotype IgG2b were able to identify not just ETEC strains expressing PCFO2 but also expressing CS6, representing an important tool for the identification of these adhesins / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/316993 |
| Date | 28 July 2018 |
| Creators | Silva, Yliria Ferreira da |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Ricci, Lucila Costallat, 1953- |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 93p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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