Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The enzyme acetylcholinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) is responsible to terminate acetylcholine activity in
the terminal nervous junctions with its effector organs or post-synaptic sites. The activity of this enzyme
could be inhibited by organophosphorus (OP) compounds, and this inactivation leads to an accumulation
of acetylcholine in the cholinergic receptors, leading to a cholinergic crisis that may result in death. In this
way, the OP compound methamidophos has been related to its broad use in various agriculture cultures in
Brazil, with high intoxication rate. Actually, the only compounds able to revert the AChE inhibition by
OP, are the oxime, such compounds may reactive the enzyme activity due its high nuclephilic power,
attacking the phosphoryl group of the inhibited enzyme and displacing it. However, such compounds
show toxic effects, and its use is limited by the high specificity, with each oxime acting only in the
reactivation of AChE induced by specific OP coumponds. These limitations raise the need of
development of new compounds with AChE reactivator potency, with minor side effects. In this way,
have been utilized a series of computational tools (in silico models), with the aim of understand the
interaction occurring at a molecular level and, so, rationalize the new compounds development. Thus, the
aim of this thesis is to evaluate the activity of three new compounds in reactivate the AChE inhibited by
methamidophos, in comparison with two others oximes used in clinical (obidoxime and pralidoxime),
both in in silico and in vitro models. Our work demonstrate that the newly synthesized compounds are
able to reactivate human erythrocyte AChE, however less efficiently than pralidoxime and obidoxime,
and reactivate human plasma butyrylcholinesterase (BChE), where the classical oximes failed. We also
show that pralidoxime, which obtained the best reactivation constant among all tested compounds, attack
the phosphorus-oxygen moiety (formed between the methamidophos and the AChE catalytic triad residue
Ser203) via a region known as oxyanion-hole , composed by the residues Gly120, Gly121 and Ala204.
Such found may help in the development of new compounds with better reactivatory activity on AChE
inhibited by OP compounds. Furthermore, we show for the first time the individual contribution of each
amino acid of AChE, in a radii of 14 Å from the ligand, to the oxime bonding to its active site, using
quantum chemistry methods. Here, we demonstrate the important of a quaternary nitrogen to the
stabilization of the oximes into the active site; as well as, we obtained evidences that the active form of
oximes should be the unprotonated one, instead the protonated, which has been target of debate in the
scientific society. Particularly important, we show the critical contribution of amino acids that lies distant
from the ligand to the adopted conformation and stabilization of the compounds into the active site of
AChE, which has been neglected until far. Finally, our study also evaluates the toxic effects of the
compound isatin-3-N4-benzilthiosemicarbazone (IBTC) in mice, which presented low toxicity, with
median lethal dose superior at 500 mg/kg. Concluding, this study contributes significantly to the
development of new drugs able to restore the AChE activity with minor toxic effects. / A enzima acetilcolinesterase (EC 3.1.1.7, AChE) é responsável por terminar a ação da acetilcolina nas
junções das terminações nervosas com seus órgãos efetores ou sítios pós-sinaptícos. A atividade desta
enzima pode ser inibida por compostos organofosforados (OP), e sua inativação resulta em um acúmulo
de acetilcolina nos receptores colinérgicos, levando a crise colinérgica que pode levar a morte. No Brasil,
se destaca o uso do composto OP metamidofós, que é largamente utilizado no controle de pragas em
culturas agrícolas e tem sido relacionado com altas taxas de intoxicação. Atualmente, os únicos
compostos capazes de reverter a inibição da AChE por OP são as oximas, tais compostos podem reativar
a enzima devido a seu alto poder nucleofílico, podendo atacar e retirar o grupamento fosforil da enzima
inibida. Porém, tais compostos apresentam efeitos tóxicos, e tem seu uso limitado pela alta especificidade,
com cada oxima atuando na AChE inibida por apenas alguns compostos OP. Tais limitações criam a
necessidade do desenvolvimento de novos fármacos com potencial reativador da AChE com menores
efeitos colaterais. Neste sentido, se tem utilizado uma série de ferramentas computacionais (modelos in
silico), com o objetivo de entender as interações que ocorrem em nível molecular e, desta forma,
racionalizar o desenvolvimento de novos compostos. Sendo assim, o objetivo desta tese consiste em
avaliar a atividade de três novos compostos, em comparação com duas oximas já utilizadas na clínica
(obidoxima e pralidoxima), sobre a atividade da AChE inibida por metamidofós, tanto em modelos in
silico como in vitro. Como resultados, observamos que os três novos compostos foram capazes de reativar
a AChE de eritrócitos humanos inibida por metamidofós, contudo com menor eficiência que as oximas já
utilizadas na clínica. Porém, todos os novos compostos foram capazes de reativar a enzima
butirilcolinesterase (BChE), uma enzima acessória à AChE no sistema colinérgico, inibida por
metamidofós, enquanto nenhumas das oximas clássicas tiveram qualquer atividade reativadora nesta
enzima. Nosso trabalho também demonstrou que a pralidoxima, que obteve a melhor constante de
reativação entre todos os compostos testados, ataca a ligação fosforo-oxigênio (formada entre o
metamidofós e o resíduo Ser203, da tríade catalítica da AChE) via uma região conhecida como
oxyanion-hole , que compreende os resíduos Gly120, Gly121 e Ala204. Tal achado pode ajudar no
desenvolvimento de novos compostos com melhor atividade reativatória na AChE inibida por OPs. Além
disso, mostramos aqui pela primeira vez, a contribuição de cada resíduo de aminoácido da AChE, num
raio de 14 Å do ligante, para a ligação das oximas no seu sítio ativo, usando métodos de química
quântica. Tais achados mostraram a importância da presença de um nitrogênio quaternário para a
estabilização das oximas no sítio ativo; assim como colheu evidências que a forma ativa das oximas seria
a sua forma desprotonada, ao invés da forma protonada, o que tem sido alvo de algum debate no meio
cientifico. Particularmente importante, foi demonstrado a contribuição fundamental de aminoácidos que
se encontram distantes do ligante, para a estabilização e conformação adotada pelos compostos, e que até
o momento tem sido negligenciados em estudos in silico. Por fim, nosso estudo também avaliou os efeitos
tóxicos do composto isatina-3-N4-benziltiosemicarbazona (IBTC) em camundongos, o qual apresentando
baixa toxicidade, com valores de dose letal mediana (LD50) superiores a 500 mg/kg. Desta forma, este
estudo contribui para a desenvolvimento de novos fármacos capazes de reativar a AChE e que apresentem
menos efeitos tóxicos.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4457 |
| Date | 04 June 2012 |
| Creators | Lugokenski, Thiago Henrique |
| Contributors | Soares, Félix Alexandre Antunes, Monserrat, José María, Franco, Jeferson Luis, Schetinger, Maria Rosa Chitolina, Loro, Vania Lucia |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica Toxicológica, UFSM, BR, Bioquímica |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 200800000002, 400, 500, 300, 500, 300, 500, 500, 3aef53b7-b173-4c56-a944-bed2de5e5dda, 31545eab-c86c-4b7a-8a80-ac940a0e681f, b5472080-62c6-4a3d-95a4-32cdf82b1007, 423a65fa-1ad8-43d9-b50e-5041a255d6a0, a5d2f3d1-0aa0-4c3b-89d3-b20a63b19b24, 8c4258ae-c78b-4a63-868b-639544b7b5d5 |
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