Tesis para optar al grado de Doctor en Bioquímica / Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en todos los países
desarrollados, incluyendo Chile. En los últimos años se ha sugerido que la pérdida de
cardiomiocitos debido a muerte celular es un factor importante en el desarrollo de la
insuficiencia cardiaca. Sin embargo, no existe claridad acerca del mecanismo por el cual se
produce la muerte de los cardiomiocitos y de su desaparición del tejido cardiaco. En el
corazón se produce estrés hiperosmótico durante eventos de isquemia/reperfusión cardiaca.
Existe un pobre conocimiento acerca de las vías de señalización cardiaca que conllevan a la
muerte celular como una consecuencia del estrés osmótico. Nosotros hemos demostrado
que el estrés hiperosmótico (sorbitol 600 mOsm) induce una rápida apoptosis en
cardiomiocitos en cultivo. El futuro desarrollo de esta área requiere la identificación de
moléculas que protejan a los cardiomiocitos de la muerte celular. En este aspecto, el agente
más promisorio corresponde al factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1).
Algunas células poseen eficientes mecanismos reguladores involucrados en la
mantención de la homeostasis, sin embargo el cardiomiocito es especialmente vulnerable a
la apoptosis inducida por estrés hiperosmótico debido a que regula su volumen muy
lentamente. Aunque existe cierta caracterización molecular de los eventos desencadenados
en la apoptosis inducida por sorbitol, se desconoce la participación del Ca2+ y de factores
transcripcionales en este proceso.
El propósito de esta tesis fue estudiar los mecanismos de señalización que regulan la
apoptosis del cardiomiocito inducida por estrés hiperosmótico. Con este objetivo, se estudió
la actividad y regulación transduccional del factor transcripcional CREB en respuesta a IGF-1
y/o estrés hiperosmótico. CREB es un importante mediador de la sobrevida celular
promovida por IGF-1 en otros tipos celulares. Por lo tanto se investigó la participación de
CREB en la señalización antiapoptótica gatillada por IGF-1 en este modelo de estrés
hiperosmótico. Además, se estudiaron los efectos del estrés hiperosmótico en cultivos
primarios de cardiomiocitos, en términos de cambios en los niveles intracelulares de Ca2+ y
en las actividades enzimáticas de la proteína kinasa dependiente de Ca2+/CaM (Calmodulina
quinasa II, CaMKII) y la proteína fosfatasa Calcineurina (Cn). Los resultados presentados en este estudio demostraron que tanto el estrés
hiperosmótico como IGF-1 conllevan a la activación de CREB, a través de su fosforilación,
aunque probablemente por vías distintas. La activación de CREB por estrés hiperosmótico
dependió de Ca2+
i y las vías MAPK, ya que BAPTA-AM e inhibidores de las vías p38-MAPK y
ERK impidieron el aumento de su fosforilación. Por otro lado, la preincubación de
cardiomiocitos con BAPTA-AM o inhibidores de las vías p38-MAPK, ERK, PI3-K, Cn and
CaMKII disminuyeron significativamente la fosforilación de CREB inducida por IGF-1. El
estrés hiperosmótico bloqueó la activación de CREB inducida por IGF-1, con un patrón de
activación similar al de el estímulo apoptótico. Finalmente, los resultados indicaron que
CREB participa en la señalización antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a
estrés hiperosmótico, pero no en la respuesta de sobrevida celular frente al estímulo
osmótico. El efecto protector de IGF-1 frente a estrés hiperosmótico fue bloqueado por la
expresión de una forma inactiva de CREB, como se demuestra con la mayoría de los
parámetros apoptóticos evaluados en este estudio; sin embargo, la apoptosis inducida con
este modelo experimental no presentó cambios significativos tras la sobreexpresión de
CREB inactivo.
Los resultados, además, demostraron que el estrés hiperosmótico llevó a aumentos
rápidos y transitorios de los niveles de Ca2+
i, como resultado tanto del influjo de este ión
desde el medio extracelular como de su liberación desde depósitos intracelulares. Este
aumento del Ca2+
i estuvo mediado al menos, por entrada de Ca2+ por canales de Ca2+ de tipo
L y la liberación desde reservorios de Ca2+ activada por IP3. Los resultados también
mostraron que la liberación de Ca2+ desde depósitos intracelulares inducida por el estrés
hiperosmótico depende de la activación de Fosfolipasa C (PLC).
El estrés hiperosmótico no produjo un aumento de las actividades enzimáticas CaMKII y
Cn. El pretratamiento de los cardiomiocitos con KN62 (inhibidor de CaMKII) y CsA (inhibidor
de Cn) no modificó significativamente la apoptosis inducida por estrés hiperosmótico,
evaluada en términos de viabilidad celular, fragmentación del DNA, activación de caspasa-3
y -9 y externalización de fosfatidilserina. Estos resultados sugieren que dichas vías de
señalización probablemente no estarían involucradas en la regulación de la apoptosis
desencadenada por el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol. De este trabajo de tesis se puede concluir que: 1) CREB participaría en la señalización
antiapoptótica del IGF-1 en cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico, pero no en la
muerte inducida por este tipo de estrés; 2) el estrés hiperosmótico produce un aumento de
los niveles Ca2+
i como consecuencia del influjo de este ión desde el medio extracelular y de
su liberación desde depósitos intracelulares; y finalmente, 3) CaMKII y Cn no participarían en
la apoptosis inducida por el estímulo osmótico / Cardiovascular diseases are the leading cause of death in all developed countries,
including Chile. In recent years, it has been suggested that loss of cardiomyocytes due to cell
death is an important causative factor in the development of heart failure. However, the
mechanism by which cardiomyocytes die and then disappear from the tissue is not clear. In
the heart, osmotic stress occurs during myocardial ischemia/reperfusion. Cardiac signaling
pathways leading to cell death as a consequence of osmotic stress remain poorly
understood. We have shown that hyperosmotic stress (sorbitol 600 mOsm) rapidly induces
apoptosis in cultured cardiomyocytes. Future development in this area will require the
identification of molecules that protect cardiac cells from cell death. The most promising
agent is insulin like growth factor-1 (IGF-1).
Several cells display efficient regulatory mechanisms involved in maintaining
homeostasis, however cardiomyocyte is especially vulnerable to hyperosmotic stress-induced
apoptosis since its volume is regulated very slowly. Although there is some molecular
characterization of the events engaged in estrés hiperosmótico-induced apoptosis, the
involvement of Ca2+ and transcription factors remains unknown.
The aim of this thesis was to study of the signaling mechanisms regulating hyperosmotic
stress-induced apoptosis of cardiomyocyte. With that purpose, the activity and transductional
regulation of transcriptional factor CREB in the response to IGF-1 and/or hyperosmotic stress
were studied. Since CREB is an important mediator of IGF-1 promotion of cell survival in
other cell types, the participation of CREB in the IGF-1-induced antiapoptotic signaling
pathway during hyperosmotic stress was also investigated. In addition effects of sorbitolinduced
hyperosmotic stress on primary cardiomyocyte cultures were studied, in terms of
changes in Ca2+ intracellular levels, Ca2+/CaM-dependent protein kinase (Calmodulin kinase
II, CaMKII) and the protein phosphatase Calcineurin (Cn) enzymatic activities. Data presented in this study showed that CREB activation (phosphorilation) was induced
by both hyperosmotic stress and IGF-1, although most likely by different pathways. CREB
activation by hyperosmotic stress depended on Ca2+
i and MAPK pathways since BAPTA-AM
and p38-MAPK and ERK pathway inhibitors prevented its phosphorylation. In the other hand,
pretreatment of cardiomyocytes with BAPTA-AM or p38-MAPK, ERK, PI3-K, Cn and CaMKII
pathway inhibitors significantly decreased CREB phosphorylation induced by IGF-1.
Hyperosmotic stress prevented CREB activation IGF-1-induced, maintaining the activation
pattern of DNA affinity displayed after the apoptotic stimulus. Finally, the results indicated that
CREB participates in the IGF-1 antiapoptotic signaling in cardiomyocytes treated with
hyperosmotic stress, but not in the cell survival response. The protective effect of IGF-1
towards sorbitol was overridden by the overexpression of an inactive form of CREB, as
shown by most of the apoptotic parameters evaluated in this study; however, stress-induced
apoptosis with this experimental model remained unchanged by overexpression of inactive
CREB.
The results also showed that hyperosmotic stress led to fast and transient increases in
intracellular Ca2+ levels, which were the result of both Ca2+ influx from the extracellular milieu
and the release from intracellular stores. This Ca2+
i increase was mediated in part by Ca2+
inward by L-type Ca2+ channels and release from stores by IP3 receptors. Results also
showed that hyperosmotic stress-induced Ca2+ release from intracellular stores was also
dependent on PLC activation.
Hyperosmotic stress did not induce CaMKII and Cn enzymatic activities. Pretreatment of
cardiomyocytes with KN62 (CaMKII inhibitor) and CsA (Cn inhibitor) did not modified
significantly hyperosmotic stress-induced apoptosis, evaluated in terms of cell viability, DNA
fragmentation, caspases–3 and –9 activation and phosphatidylserine externalization. These
results suggested that these two signaling pathways were not likely implicated in the
regulation of apoptosis triggered by sorbitol-induced hyperosmotic stress.
Conclusions drawn from this thesis work are: 1) CREB most likely is involved in IGF-1
antiapoptotic signal in cardiomyocytes subjected to hyperosmotic stress but not in this type of
stress-induced cell death; 2) hyperosmotic stress leads to an increase in intracellular Ca2+ levels due to both influx from the extracellular milieu and release from intracellular stores; and
finally, 3) CaMKII and Cn are not likely to be involved in this osmotic stimulus-induced
apoptosis / FONDAP 15010006; FONDECYT 1010246; CONICYT
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/171108 |
| Date | January 2004 |
| Creators | Maldonado Vera, Carola Patricia |
| Contributors | Lavandero González, Sergio |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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