Despite the fact that Glycosyl Hydrolase Family 32 present 4 467 enzyme entries, only 14 of them have been characterized structurally. From the ten protein crystal structures deposited for Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 at PDB just one enzyme is related to the processing of non-digestible sugars and there is no structure of a β-fructofuranosidase. In this research we studied the biochemical properties and the structural features of a recombinant β-fructofuranosidase (BaFFse) from the healthy gut bacteria B. adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) heterologously expressed in Escherichia coli Rosetta. The enzyme was purified by nickel ion affinity chromatography and molecular exclusion chromatography; the purification process was judged by denaturing SDS-PAGE gel. Sucrose was used as a substrate for the enzyme activity assays and the amount of reducing sugars, detected by Dinitrosalycilic acid, was taken as indicator of the optimum conditions of hydrolysis for the enzyme. BaFFase crystal, grown in PEG 8K 25% (w/v) and buffer MES 0.1M pH 6.5, was diffracted at 2.44 Å and processed using the CCP4 program package. The enzyme presented a classical four-stranded five-bladed β-propeller and a C-terminal β-sandwich characteristic from the GH 32 family; however, connected to the β-propeller through a loop of 38 residues, BaFFase also presented an N-terminal β-sandwich domain, which sequence (residues 3-100 from BaFFase) did not match with any protein sequence when aligned against PDB database. Assays with Gel filtration calibration, DLS and SAXS showed that the enzyme was a stable homodimer in solution. Based on the superposition of structures using the a β-fructofuranosidase from B. longum KN29.1 we could deduced the three key aminoacids involved in the transferring of fructosyl moieties by BaFFase. A nucleophile attack is performed by the carboxylate of Asp 131, forming the fructose BaFFase intermediate; Glu 375 donates a proton, acting as an acid base catalyst and Asp 269 stabilizes the transitions state in the fructosyl transferring activity. This is the first GH32 oligomeric enzyme belonging to the bacteria kingdom. We have described a novel additional β-sandwich domain for a GH32 enzyme that increases the region of contact to form a dimer. This is the first β-fructofuranosidase crystal structure from the microorganism B. adolescentis ATCC 15703. / O presente trabalho disserta sobre os estudos das propriedades bioquímicas e as características estruturais de uma β-frutofuranosidase recombinante (BaFFse) da bactéria Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 (gen BAD_1325) presente em intestinos saudáveis. A proteína foi expressa heterologamente em Escherichia coli Rosetta. A enzima foi purificada por cromatografia de afinidade (íons de níquel) e cromatografia de exclusão por massa molecular; o processo de purificação foi avaliado por gel desnaturante tipo SDS-PAGE. A sacarose foi usada como substrato para os ensaios de atividade enzimática e a quantidade de açúcares redutores, detectados por ácido dinitrosalicílico, foi tomada como indicador das condições ótimas de hidrólise para a enzima. Cristais de BaFFase, crescidos em solução contendo PEG 8 k em tampão Hepes pH 6,5, foram difratados a uma resolução de 2,44 Å e processados utilizando o pacote de programas CCP4. A enzima apresentou um clássico enovelamento tipo composto por cinco pás de quatro-fitas β cada e um domínio C-terminal sanduíche-β característico da família GH32; no entanto, ligado ao β-propeller, através de um loop de 38 resíduos, a BaFFase apresentou um inédito domínio N-terminal sanduíche-β (resíduos 3-100 de BaFFase) ainda sem precedentes, quando alinhado contra a base de dados PDB. Ensaios de gel filtração, DLS e SAXS mostraram que a enzima se apresenta como um homodímero estável em solução. Com base na superposição estrutural, utilizando uma β-frutofuranosidase de B. longum KN29.1, foi possível inferir os três aminoácidos essenciais envolvidos na transferência de unidades de frutosil pela BaFFase. Um ataque nucleofílico é realizado pelo grupo carboxílico do Asp131, formando um intermediário frutose-BaFFase; o Glu375 doa um próton, atuando como um catalisador ácido-base e o Asp269 estabiliza o estado transições na atividade de transferência frutose. Um novo domínio sanduíche-β adicional para uma enzima GH32 é descrito. Esse domínio é responsável pelo aumento da região de contato e essencial para a formação do homodímero. Esta é a primeira estrutura cristalina da β-frutofuranosidase do microrganismo B. adolescentis ATCC 15703, além de ser a primeira enzima GH32 descrita neste estado oligomérico pertencente ao reino das bactérias.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-21102016-140952 |
| Date | 24 August 2016 |
| Creators | Mera, Alain Eduard Monsalve |
| Contributors | Muniz, João Renato Carvalho |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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