As galectinas, proteínas que compartilham características como afinidade por ?-galactosídeos e a presença de um domínio de reconhecimento ao carboidrato (CRD), tem como importante papel a decodificação de mensagens moleculares. As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos (CRD1 e CRD2) conectados por um peptídeo de ligação, ao qual pertencem as galectinas-4 e -12 humanas, alvos de nosso estudo. Durante o desenvolvimento do presente projeto foram utilizadas abordagens multidisciplinares através de técnicas biofísicas, cristalográficas, computacionais e imunoquímicas. Foi iniciado o estudo de caracterização estrutural da galectina-4 humana (hGal4) e seus domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2, de forma independente, através da produção heteróloga das proteínas e ensaios de estabilidade térmica e cristalização. As estruturas cristalográficas dos domínios foram determinadas a 1,48 e 2,46 Å de resolução, respectivamente e utilizadas para a construção de um modelo para a hGal4. Com base nos estudos de dinâmica molecular e estabilidade térmica foi possível propor um modelo de interação entre os CRDs através do peptídeo de ligação. Ensaios de dinâmica da hGal4 com LacNAc sugeriram uma diferença de plasticidade dos CRDs no reconhecimento do ligante. Foram também realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as isoformas e domínios da galectina-12 humana (hGal12). Como resultado, observamos uma alta tendência à formação de corpos de inclusão e agregados resistentes a desnaturação, além da susceptibilidade ao ataque proteolítico. Os modelos estruturais dos domínios da hGal12 não permitiram identificar nenhuma característica que justificasse o comportamento das proteínas. Foram realizados estudos de localização celular em células HL-60 e foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. A alta insolubilidade observada para as isoformas e domínios da hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e incluindo o fato de um dos CRDs não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar ?-galactosídeos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD2 poderia ter evoluído para favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento de futuros estudos funcionais. / Galectins are proteins that share characteristics such as affinity for ?-galactosides and the presence of a carbohydrate recognition domain (CRD). They belong to a family of proteins that display the important role of decoding molecular messages. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (CRD1 and CRD2) connected by a peptide linker, in which belong galectins-4 and -12, targets of our study. During the development of the present project a multidisciplinary approach was used including the use of biophysical, crystallographic, computational and immunochemical techniques. The structural characterization of human galectin-4 (hGal4) and its hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 independent domains was initiated by their heterologous protein production, thermal stability and crystallization assays. The crystallographic structure of domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively, and used for constructing a model for hGal4. Based on molecular dynamics and thermal stability studies we propose a model of interaction between CRDs mediated by linker peptide. Dynamics simulation of hGal4 with LacNAc suggested a difference in plasticity between CRDs and ligand recognition. In addition, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of isoforms and independent domains from human galectin-12 (hGal12). As result, we observed a high tendency to body inclusion formation and denaturing resistant aggregates, besides high susceptibility to proteolytic attack. Structural models for the hGal12 domains did not allow the identification of any feature to justify proteins behavior. Cell location studies in HL-60 cells were performed and hGal12 was found to be located on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. The high insolubility displayed by isoforms and domains from hGal12, together with its location on lipid droplets, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for ?-galactosides binding, suggest that hGal12 is, in fact, expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD2 could have evolved in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-17042015-114333 |
| Date | 12 November 2014 |
| Creators | Joane Kathelen Rustiguel Bonalumi |
| Contributors | Maria Cristina Nonato Costa, Marcelo Dias Baruffi, André Luís Berteli Ambrósio |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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