<p>Guanylate binding proteins (Gbps) are a family of large GTPases that are highly stimulated by IFNγ and confer resistance to various viral, protozoan, and bacterial pathogens. Following infections of intracellular pathogens, multiple Gbps can localize to pathogen vacuoles and promote the vesiculation and destruction of these structures. While Gbps have also been implicated in pathways independent of vacuolar disruption, their roles in these processes have been less characterized. In this dissertation, I focus on the mechanism of Gbps downstream of vacuolar disruption in order to further elucidate the role of these proteins during immune responses. </p><p> Due to the IFNγ stimulation of caspase-11 pyroptosis, I first addressed the ability of Gbps to promote the non-canonical caspase-11 dependent pathway of pyroptosis. I found that Gbpchr3-/- cells had reduced cell death in response to the vacuolar pathogen, L. pneumophila, and various LPS ligands. Using YFP-Gal3 as a marker for damaged membranes, I showed that there were equivalent levels of damaged pathogen vacuoles between WT and Gbpchr3-/- cells suggesting these proteins promoted pyroptosis independently of vacuolar disruption. Instead, it appears that Gbps modulate the activation of caspase-11 following LPS release into the cytosol. </p><p> The recruitment of Gbps is mediated by multiple host proteins including the Immunity Related GTPases and the autophagy conjugation system. I found in the second study that at least one Gbp, Gbp2, was also recruited to damaged vacuoles through the aid of Galectin-3, a β-galactoside binding protein, as well as the autophagy adaptor protein, p62. As all three proteins were also recruited to sterile damaged vesicles created by hypotonic shock, calcium phosphate precipitates, and lysosomal damage, it suggests Gbps are recruited through a universal mechanism which is independent of PAMP recognition. Interactions between p62, Gbp2, and Gal3 present a model whereby p62 facilitates the recruitment of Gbp2 to damaged membranes through interactions with Galectin-3. Their localization to these sites may subsequently facilitate autophagic degradation of membranes or promote the recruitment of pyroptotic complexes to modulate immune functions although this remains to be elucidated. </p><p> This dissertation examines the less characterized roles of Gbps downstream of vacuolar disruption. By uncovering these alternative pathways, this work provides a foundation to study the variations within the Gbp family and allows for the field to further understand the mechanisms by which they promote cellular immune responses.</p> / Dissertation

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As galectinas, proteínas que compartilham características como afinidade por ?-galactosídeos e a presença de um domínio de reconhecimento ao carboidrato (CRD), tem como importante papel a decodificação de mensagens moleculares. As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos (CRD1 e CRD2) conectados por um peptídeo de ligação, ao qual pertencem as galectinas-4 e -12 humanas, alvos de nosso estudo. Durante o desenvolvimento do presente projeto foram utilizadas abordagens multidisciplinares através de técnicas biofísicas, cristalográficas, computacionais e imunoquímicas. Foi iniciado o estudo de caracterização estrutural da galectina-4 humana (hGal4) e seus domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2, de forma independente, através da produção heteróloga das proteínas e ensaios de estabilidade térmica e cristalização. As estruturas cristalográficas dos domínios foram determinadas a 1,48 e 2,46 Å de resolução, respectivamente e utilizadas para a construção de um modelo para a hGal4. Com base nos estudos de dinâmica molecular e estabilidade térmica foi possível propor um modelo de interação entre os CRDs através do peptídeo de ligação. Ensaios de dinâmica da hGal4 com LacNAc sugeriram uma diferença de plasticidade dos CRDs no reconhecimento do ligante. Foram também realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as isoformas e domínios da galectina-12 humana (hGal12). Como resultado, observamos uma alta tendência à formação de corpos de inclusão e agregados resistentes a desnaturação, além da susceptibilidade ao ataque proteolítico. Os modelos estruturais dos domínios da hGal12 não permitiram identificar nenhuma característica que justificasse o comportamento das proteínas. Foram realizados estudos de localização celular em células HL-60 e foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. A alta insolubilidade observada para as isoformas e domínios da hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e incluindo o fato de um dos CRDs não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar ?-galactosídeos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD2 poderia ter evoluído para favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento de futuros estudos funcionais. / Galectins are proteins that share characteristics such as affinity for ?-galactosides and the presence of a carbohydrate recognition domain (CRD). They belong to a family of proteins that display the important role of decoding molecular messages. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (CRD1 and CRD2) connected by a peptide linker, in which belong galectins-4 and -12, targets of our study. During the development of the present project a multidisciplinary approach was used including the use of biophysical, crystallographic, computational and immunochemical techniques. The structural characterization of human galectin-4 (hGal4) and its hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 independent domains was initiated by their heterologous protein production, thermal stability and crystallization assays. The crystallographic structure of domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively, and used for constructing a model for hGal4. Based on molecular dynamics and thermal stability studies we propose a model of interaction between CRDs mediated by linker peptide. Dynamics simulation of hGal4 with LacNAc suggested a difference in plasticity between CRDs and ligand recognition. In addition, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of isoforms and independent domains from human galectin-12 (hGal12). As result, we observed a high tendency to body inclusion formation and denaturing resistant aggregates, besides high susceptibility to proteolytic attack. Structural models for the hGal12 domains did not allow the identification of any feature to justify proteins behavior. Cell location studies in HL-60 cells were performed and hGal12 was found to be located on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. The high insolubility displayed by isoforms and domains from hGal12, together with its location on lipid droplets, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for ?-galactosides binding, suggest that hGal12 is, in fact, expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD2 could have evolved in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.

As galectinas, proteínas que compartilham características como afinidade por ?-galactosídeos e a presença de um domínio de reconhecimento ao carboidrato (CRD), tem como importante papel a decodificação de mensagens moleculares. As galectinas são encontradas em uma grande variedade de células e tecidos animais e estão envolvidas em diversos processos celulares relacionados a resposta imune e inflamatória. O grupo tandem-repeat das galectinas é formado por proteínas que apresentam dois CRDs distintos (CRD1 e CRD2) conectados por um peptídeo de ligação, ao qual pertencem as galectinas-4 e -12 humanas, alvos de nosso estudo. Durante o desenvolvimento do presente projeto foram utilizadas abordagens multidisciplinares através de técnicas biofísicas, cristalográficas, computacionais e imunoquímicas. Foi iniciado o estudo de caracterização estrutural da galectina-4 humana (hGal4) e seus domínios hGal4-CRD1 e hGal4-CRD2, de forma independente, através da produção heteróloga das proteínas e ensaios de estabilidade térmica e cristalização. As estruturas cristalográficas dos domínios foram determinadas a 1,48 e 2,46 Å de resolução, respectivamente e utilizadas para a construção de um modelo para a hGal4. Com base nos estudos de dinâmica molecular e estabilidade térmica foi possível propor um modelo de interação entre os CRDs através do peptídeo de ligação. Ensaios de dinâmica da hGal4 com LacNAc sugeriram uma diferença de plasticidade dos CRDs no reconhecimento do ligante. Foram também realizadas incessantes tentativas de desenvolver um protocolo de expressão heteróloga para as isoformas e domínios da galectina-12 humana (hGal12). Como resultado, observamos uma alta tendência à formação de corpos de inclusão e agregados resistentes a desnaturação, além da susceptibilidade ao ataque proteolítico. Os modelos estruturais dos domínios da hGal12 não permitiram identificar nenhuma característica que justificasse o comportamento das proteínas. Foram realizados estudos de localização celular em células HL-60 e foi possível identificar a presença da hGal12 na superfície das gotas de lipídio, organelas responsáveis pelo armazenamento de energia e o processo de catabolismo celular. A alta insolubilidade observada para as isoformas e domínios da hGal12, a sua localização em gotas de lipídeos, a divergência evolutiva da hGal12 quando comparada com outras galectinas do mesmo grupo e incluindo o fato de um dos CRDs não apresentar os requerimentos estruturais básicos para ligar ?-galactosídeos, nos leva a especular se essa proteína estaria, na verdade, sendo expressa como parte de um heterocomplexo proteico, que estabilizaria a estrutura da hGal12 e a endereçaria para as gotas de lipídeo. Em nossa hipótese, o domínio hGal12-CRD2 poderia ter evoluído para favorecer a interação com outros parceiros macromoleculares. Devido ao importante papel desempenhado pelas galectinas em inúmeros processos celulares, os resultados aqui obtidos representam uma importante contribuição no entendimento do papel que as galectinas hGal4 e hGal12 exercem nos diferentes eventos celulares, além de fornecem ferramentas experimentais para desenvolvimento de futuros estudos funcionais. / Galectins are proteins that share characteristics such as affinity for ?-galactosides and the presence of a carbohydrate recognition domain (CRD). They belong to a family of proteins that display the important role of decoding molecular messages. Galectins are found in a variety of cell types and are involved in several biological phenomena related to immune response and inflammation. The tandem-repeat group of galectins consists of proteins with two distinct CRDs (CRD1 and CRD2) connected by a peptide linker, in which belong galectins-4 and -12, targets of our study. During the development of the present project a multidisciplinary approach was used including the use of biophysical, crystallographic, computational and immunochemical techniques. The structural characterization of human galectin-4 (hGal4) and its hGal4-CRD1 and hGal4-CRD2 independent domains was initiated by their heterologous protein production, thermal stability and crystallization assays. The crystallographic structure of domains were determined at 1.48 e 2.46 Å resolution, respectively, and used for constructing a model for hGal4. Based on molecular dynamics and thermal stability studies we propose a model of interaction between CRDs mediated by linker peptide. Dynamics simulation of hGal4 with LacNAc suggested a difference in plasticity between CRDs and ligand recognition. In addition, several attempts have been made towards the development of a protocol for expression of isoforms and independent domains from human galectin-12 (hGal12). As result, we observed a high tendency to body inclusion formation and denaturing resistant aggregates, besides high susceptibility to proteolytic attack. Structural models for the hGal12 domains did not allow the identification of any feature to justify proteins behavior. Cell location studies in HL-60 cells were performed and hGal12 was found to be located on the surface of lipid droplets, organelles responsible for energy storage and catabolism. The high insolubility displayed by isoforms and domains from hGal12, together with its location on lipid droplets, the evolutionary divergence of hGal12 compared to tandem-repeat proteins, and the fact that hGal12-CRD2 does not present the structural requirements for ?-galactosides binding, suggest that hGal12 is, in fact, expressed as part of a protein complex that could both stabilize hGal12 structure and guide it to the lipid droplets. In our hypothesis, the hGal12-CRD2 could have evolved in order to favor the interaction with other macromolecular partners. Due to crucial roles displayed by galectins in innumerous biological process, we believe that our results represent an important contribution for the understanding of hGal4 e hGal12 proteins roles within the cell, besides providing experimental tools for the development of further functional studies.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarianneVC_Dissert.pdf: 1419234 bytes, checksum: 19a586a86828d12941eac044033e933c (MD5) Previous issue date: 2010-02-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Introdu??o: A displasia epitelial oral (DEO) ? uma les?o potencialmente maligna, cujo diagn?stico e grada??o se baseia na histologia das altera??es arquiteturais e citol?gicas, preconizados pela OMS, que divide a les?o em leve, moderada e severa, o qual ? subjetivo. Maior concord?ncia ? observada no uso do sistema bin?rio (baixo/alto risco), o qual est? relacionado ao risco de transforma??o maligna. As galectinas constituem uma fam?lia de lectinas e est?o envolvidas na tumorig?nese, sendo a -1, -3 e -7 as mais investigadas, devido a express?o alterada em c?nceres orais. Materiais e m?todos: Foi analisada a express?o imuno-histoqu?mica dessas prote?nas em 50 esp?cimes de DEO (21 baixo/ 29 alto risco) e 5 de mucosa oral normal e relacionamos com a presen?a/aus?ncia de marca??o, padr?o de distribui??o, intensidade, localiza??o epitelial (estratifica??o) (1/3 inferior, m?dio e superior), e localiza??o celular (compartimento) (n?cleo, citoplasma e membrana) . Resultados: Dos 29 casos de alto e dos 21 de baixo risco, 21 (72,4%) e 12 (57,1%) foram positivos para a galectina -1, respectivamente. Dessa forma, de 50 casos, 33 foram positivos. O n?cleo e citoplasma foram positivos em 91,7% nas de baixo risco e em 90,5% nas de alto. Todos os casos de mucosa normal foram negativos. Com rela??o a galectina -3, dos 21 casos das DEOs de baixo risco, 12 (57,1%) apresentaram express?o e dos 29 casos das DEOs de alto risco, 15 (51,7%) foram positivos, havendo imunoexpress?o em um total de 27 casos. O padr?o difuso, assim como a fraca intensidade foram os mais freq?entes para os 2 graus. O n?cleo e o citoplasma foram a localiza??o mais comum tanto nas les?es de baixo (58,3%), quanto nas de alto risco (66,7%). Quatro casos de mucosa normal foram positivos, com marca??o membranar e intensidade fraca. Dos 21 casos das DEOs de baixo risco, 17 (81%) apresentaram express?o imuno-histoqu?mica para a galectina -7 e das 29 DEOs de alto risco, 27 (93,1%) foram positivos. Ent?o, a express?o imuno-histoqu?mica da galectina -7 foi observada em 44 casos, a maioria com intensidade de moderada a forte. O n?cleo e o citoplasma foram a localiza??o mais freq?ente, nas de baixo (70,6%) e alto risco (66,7%). Quatro esp?cimes de mucosa normal marcaram membrana em ter?o m?dio e superior, com intensidade moderada a forte. Conclus?es: Altera??es na express?o das galectinas -3 e -7 e principalmente da -1 sugerem seu envolvimento na fisiopatologia das displasias, participando do processo de transforma??o de fen?tipo normal para o displ?sico. / Introdu??o: A displasia epitelial oral (DEO) ? uma les?o potencialmente maligna, cujo diagn?stico e grada??o se baseia na histologia das altera??es arquiteturais e citol?gicas, preconizados pela OMS, que divide a les?o em leve, moderada e severa, o qual ? subjetivo. Maior concord?ncia ? observada no uso do sistema bin?rio (baixo/alto risco), o qual est? relacionado ao risco de transforma??o maligna. As galectinas constituem uma fam?lia de lectinas e est?o envolvidas na tumorig?nese, sendo a -1, -3 e -7 as mais investigadas, devido a express?o alterada em c?nceres orais. Materiais e m?todos: Foi analisada a express?o imuno-histoqu?mica dessas prote?nas em 50 esp?cimes de DEO (21 baixo/ 29 alto risco) e 5 de mucosa oral normal e relacionamos com a presen?a/aus?ncia de marca??o, padr?o de distribui??o, intensidade, localiza??o epitelial (estratifica??o) (1/3 inferior, m?dio e superior), e localiza??o celular (compartimento) (n?cleo, citoplasma e membrana) . Resultados: Dos 29 casos de alto e dos 21 de baixo risco, 21 (72,4%) e 12 (57,1%) foram positivos para a galectina -1, respectivamente. Dessa forma, de 50 casos, 33 foram positivos. O n?cleo e citoplasma foram positivos em 91,7% nas de baixo risco e em 90,5% nas de alto. Todos os casos de mucosa normal foram negativos. Com rela??o a galectina -3, dos 21 casos das DEOs de baixo risco, 12 (57,1%) apresentaram express?o e dos 29 casos das DEOs de alto risco, 15 (51,7%) foram positivos, havendo imunoexpress?o em um total de 27 casos. O padr?o difuso, assim como a fraca intensidade foram os mais freq?entes para os 2 graus. O n?cleo e o citoplasma foram a localiza??o mais comum tanto nas les?es de baixo (58,3%), quanto nas de alto risco (66,7%). Quatro casos de mucosa normal foram positivos, com marca??o membranar e intensidade fraca. Dos 21 casos das DEOs de baixo risco, 17 (81%) apresentaram express?o imuno-histoqu?mica para a galectina -7 e das 29 DEOs de alto risco, 27 (93,1%) foram positivos. Ent?o, a express?o imuno-histoqu?mica da galectina -7 foi observada em 44 casos, a maioria com intensidade de moderada a forte. O n?cleo e o citoplasma foram a localiza??o mais freq?ente, nas de baixo (70,6%) e alto risco (66,7%). Quatro esp?cimes de mucosa normal marcaram membrana em ter?o m?dio e superior, com intensidade moderada a forte. Conclus?es: Altera??es na express?o das galectinas -3 e -7 e principalmente da -1 sugerem seu envolvimento na fisiopatologia das displasias, participando do processo de transforma??o de fen?tipo normal para o displ?sico.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-05T16:39:15Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Tese-MoacyrRêgol.pdf: 2001004 bytes, checksum: 1fa7b5e19c232f34bd9c8735fac6c753 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T16:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2011-Tese-MoacyrRêgol.pdf: 2001004 bytes, checksum: 1fa7b5e19c232f34bd9c8735fac6c753 (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Este trabalho objetivou analisar a expressão de Galectina=1(Gal=1), Galectina=3 (Gal=3) e ligantes de lectinas em ambientes hipóxicos e/ou privados de nutrientes em célula de câncer de mama e em biópsias tumorais. Para modelar o evento in vitro a linhagem celular de câncer de mama T47D foi submetida à hipóxia em câmara de hipóxia durante 24, 48 e 72h com ou sem privação de nutrientes. Os grupos controles (normóxia com ou sem nutrientes) foram mantidos em estufa de CO2. As biópsias tumorais de carcinoma ductal invasivo (CDI) foram divididas em dois grupos: um positivo e outro negativo para o marcador de hipóxia (CA IX) assim como as biópsias de carcinoma ductal in situ (CDIS) foram divididas em comedônicas/hipóxas e não=comedônicas/controle, para posterior comparação quanto aos parâmetros clínicos, histopatológicos e glicobiológicos. Os experimentos com T47D mostraram que a expressão de Gal=3 aumenta progressivamente quando submetida à hipóxia e privação de nutrientes durante 24, 48, 72h. As biopsias de CDI positivas para CA IX apresentaram uma marcação nuclear mais intensa que o grupo negativo e características tumorais mais agressivas como invasão linfonodal e ausência de Receptor de estrógeno. Gal=1 não foi expressa pelas células neoplásicas no modelo in vitro bem como nas biópsias, onde foi possível detectar positividade nas células do estroma associadas ao tumor. Quanto ao papel da Gal=3 na proteção a morte celular, utilizando=se citômetria de fluxo, observou=se que não houve correlação entre a inibição do domínio de reconhecimento a carboidratos da proteína e o aumento de morte celular. Entretanto, foi observada indução a morte para o anticorpo monoclonal M338, específico para o N=terminal de Gal=3, sendo esta marcação aumentada em até três vezes durante o aumento de morte celular em 48h e 72h de hipóxia e privação de nutrientes. A histoquímica com lectinas foi utilizada em amostras de CDIS com Con A, WGA e UEA=I e de CDI com L=PHA e SNA. Nos casos de CDIS as lectinas utilizadas reconheceram mais casos do grupo comedônico (hipóxico) que o não=comedônico. Ao passo que nas biópsias de CDI foi observado um aumento na sialilação assim como nas células T47D (in vitro) onde se pode avaliar que esta glicosilação não é de responsabilidade exclusiva de ST6GALNac. Nossos resultados indicam que ocorre uma glicosilação aberrante no ambiente hipóxico in vitro e in vivo associada a um fenótipo tumoral mais agressivo bem como sugere que Gal=3 participa da proteção contra morte celular e informativa para diagnóstico e prognóstico. / This study aimed to analyze the expression of Galectin=1, Galectin=3 and lectin ligands in hypoxic environments starved or not of nutrients in breast cancer cells and in tumour biopsies. In vitro experiments in T47D breast cancer cells were subjected to hypoxia in hypoxia chamber for 24, 48 and 72h with or without nutrients; control groups (in normoxia and nutrients supplied) were kept in CO2 incubator. Invasive ductal carcinoma (IDC) biopsies were divided into two groups: one positive and one negative for hypoxia marker Carbonic Anhydrase (CA IX); and Ductal Carcinoma in situ (DCIS) samples were divided in comedonecrosis/hypoxic or non=comedonecrosis/control groups, and then they were compared to clinical, histopathological and glycobiology aspects. Confocal microscopy, real=time PCR and western blotting showed that Galectin=3 expression was predominantly nuclear and increased progressively when subjected to hypoxia for 24, 48, 72h and nutrient starvation. CDI samples positive for hypoxia marker CA IX presented an intense nuclear staining in comparison to control group besides more aggressive tumour features as node positivines and absence of ER staining. Gal=1 was not expressed by neoplastic cells in cell model and biopsies, where it was possible to detect positivity in tumour=associated stroma. The evaluation of Gal=3 role in cell death protection using flow cytometry showed that there was no correlation between inhibition of Gal=3 carbohydrate recognition domain and the increase in cell death rate. However, it was observed that monoclonal antibody M338, specific to Gal=3 N=terminal, positivity increased with the increasing of dead cells after 48h and 72h under hypoxia and starvation. Lectin histochemistry for Gal=3 ligands or Gal=3=ligant complex preventing carbohydrates were investigated using Con A, WGA, PNA and UEA=I for DCIS and L=PHA, SNA and VVA for CDI. Results indicated that in CDIS the lectins used recognized more intensely the comedogenic/hypoxic group while in CDI samples were observed an increase in sialylation as well as in T47D cells indicating that ST6GALNac is not the only responsible for this event. Our results indicate that aberrant glycosylation occurs in hypoxic environments associated with a high aggressive tumour phenotype providing information of diagnostic and prognostic value. Results also suggest that Gal=3 participates in the protection of cell death by N=terminal and that sialylation in hypoxic environment is not mainly caused by N=glycosylation.

O melanoma é a forma mais letal entre os cânceres de pele. Essa neoplasia freqüentemente apresenta-se resistente a abordagens terapêuticas. A angiogênese associada ao tumor representa um crítico passo da tumorigênese, resultado da ação de diferentes citocinas e fatores de crescimento como VEGF produzidos no microambiente tumoral. As galectinas extracelulares participam de múltiplos processos biológicos incluindo angiogênese tumoral e metástases, sua interação com as células presentes no microambiente tumoral pode ocorrer via receptores toll-like sugerindo seu envolvimento nos processos pro-inflamatórios e na secreção de citocinas. Recentemente mostramos que a ausência de gal-3 no estroma e parênquima tumoral diminui a angiogênese por interferir na resposta de macrófagos via VEGF e/ou TGFbeta1. Entretanto, o envolvimento de galectinas extracelulares na angiogênese e na modulação do sistema imune no microambiente tumoral ainda não está esclarecido. Assim, este estudo visa buscar respostas ao envolvimento das galectinas no crescimento tumoral e angiogênese contribuindo ao combate do melanoma maligno. Nossos resultados mostram a participação das galectinas 1 e 3 no crescimento tumoral e seu envolvimento com macrófagos via receptores toll-like, além de coordenarem a modulação do perfil de polarização de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos wild-type. Dessa forma, podemos inferir que essas galectinas agem como coordenadoras de mudança de perfil dos macrófagos, uma vez que inibidas extracelularmente promovem uma diminuição do crescimento tumoral em camundongos wild-type, inoculados com células de melanoma murino e uma manutenção do perfil de macrófagos M1 in vitro. Assim, concluimos que as galectinas 1 e 3 extracelulares são importantes para o crescimento tumoral de melanomas murinos pois promovem o crescimento tumoral e são coordenadoras da mudança do perfil de macrófagos / Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. This tumor often presents itself resistant to therapeutic approaches. The tumor-associated angiogenesis is a critical step in tumorigenesis and the result of the action of several cytokines and growth factors such as VEGF produced in the tumor microenvironment. The extracellular galectins participate in multiple biological processes including tumor angiogenesis and metastasis, their interaction with cells present in the tumor microenvironment may occur via toll-like receptors suggesting their involvement in pro-inflammatory processes and the secretion of cytokines. We have recently shown that the absence of Gal-3 the stroma and tumor parenchyma decreases angiogenesis by interfering with the macrophage response by VEGF and / or TGFbeta1. However, the involvement of extracellular galectins on angiogenesis modulation of the immune system in the tumor microenvironment is not yet clear. This study aims is to find answers to the involvement of galectins on tumor growth and angiogenesis contributing to the study of the malignant melanoma. Our results demonstrate the involvement of galectin 1 and 3 on tumor growth and its involvement in macrophage by toll-like receptors pathway, and coordinating the modulation of the polarization profile in wild-type mice bone marrow derived macrophages. Therefore, we show these galectins act as coordinators of macrophages profile change, since inhibited extracellularly promote a reduction in tumor growth in wild-type mice inoculated with murine melanoma cells and macrophages M1 maintenance of profile in vitro. Thus, we conclude that galectins 1 and 3 extracellular are important for tumor growth of murine melanomas because they promote tumor growth and are coordinators of change macrophages profile

Lectins are multivalent carbohydrate binding proteins that specifically recognise diverse sugar structures and mediate a variety of biological processes, such as cell-cell and host-pathogen interactions, serum glycoprotein turnover and innate immune responses. Lectins have received considerable attention in recent years on account of their properties which have led to their wide use in research and biomedical applications. Seeds of leguminous plants are rich sources of lectins, but they are also found in all classes and families of organisms. Legume lectins have similar tertiary structures, but exhibit a large variety of quaternary structures. The carbohydrate binding site in them is made up of four loops, the first three of which are highly conserved in all legume lectins. The fourth loop, which is variable, is implicated in conferring specificity. Legume lectins which share the same monosaccharide specificity often exhibit markedly different oligosaccharide specificities. The introductory chapter gives a broad overview of lectins from a structural point of view. The rest of the thesis is primarily concerned with structural studies on lectins from seeds of the winged bean (Psophocarpus tetragonolobus). Winged bean seeds contain a basic lectin (WBAI) (pi > 9.5) and an acidic lectin (WBAII) (pi -5.5). Both these lectins are N-glycosylated homodimers with about 240 amino acid residues per monomer. They show a high affinity for methyl-a-D-galactose at the monosaccharide level but have entirely different affinities for oligosaccharides. WBAI agglutinates human type A and B erythrocytes but not O type, while WBAII binds specifically to the terminally monofucosylated H-antigenic (responsible for O blood group reactivity) determinants on the cell surface. In this context, the current study seeks to characterise the carbohydrate binding site of a saccharide-free form of WBAI and determine the structural basis of carbohydrate recognition in WBAII. The study also aims to identify the factors responsible for the differences in carbohydrate specificities between WBAI and WBAII. Diffraction data from a saccharide-free crystal form of WBAI and two crystal forms (Form I and II) of WBAII complexed with methyl-a-D-galactose were collected on a MAR imaging plate system mounted on a Rigaku RU200 rotating anode X-ray generator. The data were processed using the MAR-XDS and DENZO/SCALEPACK suites of programs. The structures were solved by the molecular replacement method using AMoRe. The model used in the case of WBAI and Form I of WBAII was the structure of WBAI in complex with methyl-a-D-galactose (PDB coderlWBL), while the structure of Form II of WBAH was solved using a partially refined model of Form I. The refinements and model building were performed using the programs X-PLOR/CNS and O respectively. A comparison of the structures of the saccharide-free and bound forms of WBAI revealed three water molecules occupying the carbohydrate binding site, which mimic the hydrogen bonded interactions made by the saccharide in the structure of the complex. Also a shift of -0.6 A in the variable loop, towards the saccharide in the structure of the complex was observed. Significant differences in the conformation of a loop involved in crystal packing interactions were also observed. An analysis of protein hydration demonstrates, among other things, the role of water molecules in stabilising the structure of the loops around the carbohydrate binding site. The crystal structures of the two forms of WBAH were solved at 3.0 A and 3.3. A resolution. The structure of the complex revealed the role of the length of the variable loop in generating the difference in oligosaccharide specificity between WBAI and WB All. The difference in the pi values between the two lectins is caused by substitutions occurring in loops and edges of sheets. A distinct structural difference between WBAH and all the other legume lectins of known structure is in the new disposition of the 34-45 loop with an r.m.s deviation of -6.0A in Coc positions compared to its position in other lectins. This change in conformation is caused by the formation of salt bridges by amino acid residues unique to WB All in the 34-45 loop and its neighbourhood. Thermodynamic studies on the binding of H-antigenic determinant to WBAII showed a predominance of entropic contribution suggesting a hydrophobically driven binding, not yet observed in lectin-sugar interactions. An analysis involving the docking of H-type II trisaccharide (Fuca(l-2)Galf}(l-4)GlcNAc) into the carbohydrate binding site and a comparison with the binding sites of other legume lectins revealed the role of a Tyr in the variable loop and an Asn in the second loop that are unique to WBAII in generating this unique binding property. Earlier work on peanut lectin and WBAI demonstrated that the modes of dimerisation of legume lectins are governed by features intrinsic to the protein. A phylogenetic analysis of the sequences of all legume lectins whose structures are available has been performed to examine the relationship among the various classes of oligomers and classes of sugar specificity. The information thus obtained showed that groups of legume lectins that share a common mode of dimerisation cluster together. A sequence alignment based on structures revealed amino acid residues unique to each of these clusters that may be important in determining the modes of observed dimerisation. While pursuing structural studies on WBAI and WBAII, the author has also been involved in an ongoing small molecule project in the laboratory, which involves preparation and X-ray structure determination of the complexes of carboxylic acids with amino acids and peptides. The work carried out in the project is described in the appendix.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PollianaMA.pdf: 3849977 bytes, checksum: 1bd9caa4d33368bb137c3e70ddabe0df (MD5) Previous issue date: 2009-03-06 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Several studies are carried out with aim to establish parameters to determine biologic behavior of oral squamous cell carcinoma, in order this neoplasm presents high rates of morbidity and mortality. The purpose of present research was to performe a clinic, morphologic and immunohistochemical analysis by the expression of galectins 1, 3, 4 and 7 in 65 cases of tongue squamous cell carcinoma, correlating this expression with clinics (outcome of the disease, metastasis and clinical staging) and morphologic parameters (malignancy histologic gradation system). The clinical and morphologic parameters analysed and expression of galectins 1, 3, 4 and 7 were submitted to statistical analysis (Qui2 test), observing that can be utilized as indicators of the biological behavior of the tongue squamous cell carcinoma. The galectin 1 was expressed in 87,7% of cases studied and it exhibit statistically significant correlation with metastasis (p=0,033) and clinical staging (p=0,016), it is located mostly in the citoplasm of the stomal cells. The immunoexpression of galectin 3 in 87,7% of cases was correlated with the presence of metastasis (p=0,033) and malignancy histological gradation system (p=0,031), observed, mostly of cases, in tongue squamous cell carcinoma of malignancy high grading. The galectin 4 showed no statistical significance to any of the parameters evaluated. The expression of galectin 7 in 73,8% of cases showed statistically significant correlation with the malignancy histologic grading (p=0,005), which is marking exclusively found in neoplastic epithelial cells, in the mostly of cases, it is found in cytoplasm and membrane (50%). The expressive immunopositivy of the galectins 1, 3 and 7, observed in this research, leads us to suggest a broad participation of these proteins in oral carcinogenesis, and its possible use as markers of biological behavior and tumor progression in cases of squamous cell carcinoma of the tongue / Diversos estudos s?o desenvolvidos com o intuito de se estabelecer par?metros para determinar o comportamento biol?gico do carcinoma epiderm?ide oral, tendo em vista que esta neoplasia apresenta altas taxas de morbidade e mortalidade. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma an?lise cl?nica, morfol?gica e imuno-histoqu?mica atrav?s da express?o das galectinas 1, 3, 4 e 7 em 65 casos de carcinoma epiderm?ide de l?ngua, correlacionando essa express?o ? par?metros cl?nicos (desfecho da doen?a, met?stase, estadiamento cl?nico) e morfol?gicos (sistema de grada??o histol?gica de malignidade). Os par?metros cl?nicos e morfol?gicos analisados e a express?o das galectinas 1, 3, 4 e 7 foram submetidos a an?lise estat?stica (teste do Qui 2), observando-se que os mesmos podem ser utilizados como indicadores do comportamento biol?gico do carcinoma epiderm?ide de l?ngua. A galectina 1 foi expressa em 87,7% dos casos, apresentando correla??o estatisticamente significativa com a met?stase (p=0,033) e o estadiamento cl?nico (p=0,016), localizando-se principalmente no citoplasma das c?lulas estromais. A imunomarca??o da galectina 3, em 87,7% dos casos, correlacionou-se com a presen?a de met?stases (p=0,033) e a grada??o histol?gica de malignidade (p=0,031), sendo encontrada, na maioria dos casos, em carcinoma epiderm?ide de l?ngua de alto grau de malignidade. A galectina 4 n?o exibiu signific?ncia estat?stica com nenhum dos par?metros avaliados. A marca??o da galectina 7, em 73,8% dos casos, exibiu correla??o estatisticamente significativa com a grada??o histol?gica de malignidade (p=0,005), sendo esta marca??o exclusivamente encontrada nas c?lulas neopl?sicas, e na maioria dos casos, encontrada no citoplasma e membrana (50%). A expressiva imunomarca??o das galectinas 1, 3 e 7, verificada em nossa pesquisa, nos leva a sugerir uma ampla participa??o dessas prote?nas na carcinog?nese oral, bem como a sua poss?vel utiliza??o como marcadores do comportamento biol?gico e da progress?o tumoral em carcinoma epiderm?ide de l?ngua

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-11-16T12:52:55Z No. of bitstreams: 1 PDF - Lívia Natália Sales Brito.pdf: 2789141 bytes, checksum: 2061338da949c4cb6621e8aab9b3ce0a (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-11-16T14:19:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Lívia Natália Sales Brito.pdf: 2789141 bytes, checksum: 2061338da949c4cb6621e8aab9b3ce0a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-16T14:19:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Lívia Natália Sales Brito.pdf: 2789141 bytes, checksum: 2061338da949c4cb6621e8aab9b3ce0a (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Studies demonstrate that galectins are involved in the development of immunoinflammatory response, by regulation of homeostasis and immune cell functions. However, the function of these lectins in the development of periapical lesions are scarce in the literature. The objective of this study was to evaluate, through immunohistochemistry, the expression of galectinas -1, -3 and -7 in periapical granulomas (PGs), radicular cysts (RCs), and residual radicular cysts (RRCs), related this with morphological parameters (intensity of the inflammatory infiltrate and the thickness of the cystic epithelial lining). The sample consisted of 20 periapical granulomas (PGs), 20 radicular cysts (RCs), and 20 residual radicular cysts (RRCs) were submited to immunohistochemistry. The inflammatory and epithelial cells were quantified from nuclear and/or cytoplasmic/membrane expression and their percentage submited for statistical evaluation. The results for the morphological analysis revealed that 100% of GPs and 80% of CRs showed an intense inflammatory infiltrate (grade III), and to CRRs, 60% had a mild inflammatory infiltrate (grade I). The analysis of epithelial lining in cystic lesions showed that atrophic ephitelium was observed in 65% of CRRs and 50% of the RCs, the hyperplastic ephitelium was demonstrated, respectively, in 50% and 35% of the RCs of CRRs. Immunohistochemical evaluation of each galectin in connective tissue demonstrated that GPs exhibited higher expression of galectin -1 in relation to RCs and CRRs in both components (nucleus and cytoplasmic/membrane) of inflammatory cells (p <0.05). Additionally, lesions that exhibit inflammation grade II had an increased expression of galectin-1 in both cell components (p <0.05). Galectin-3 showed no differences statistically significant in inflammatory cells of connective tissue (p> 0,05). In Galectin-7, GPs showed a higher immunoreactivity of this protein in cytoplasmic/membrane component, compared to CRs and CRRs (p <0.05) and independently of the type of lesion, those with inflammatory infiltrate grade III had greater immunoreactivity of galectin-7 (p <0.05). In the epithelial lining, galectins -1 and -3 showed no statistically significant differences of immunoreactivity (p> 0.05). However, the immunohistochemical expression of galectin-7 revealed that epithelial lining of CRRs showed a higher percentage of nuclear expression than CRs epithelial lining (p = 0.014). Lesions with hyperplastic epithelium showed a greater cytoplasmic/membrane positivity than lesions with atrophic epithelium (p=0.020). Positive correlations were observed to each galectin on epitelial and connective tissues. In addition, positive correlations were observed between galectins -1 and -7 into connective tissue (p <0.001), independent the type of lesion. In conclusion, the results of this study show the involvement of these proteins in the modulation of immunoinflammatory response among periapical lesions. / Estudos revelam que as galectinas exercem importante papel na resposta imunoinflamatória, através da regulação da homeostase e em funções de células imunes. Todavia, a participação destas proteínas no desenvolvimento de lesões periapicais ainda não foi esclarecida. O objetivo do estudo foi avaliar, por meio de imunoistoquímica, a expressão das galectinas -1, - 3 e -7 em granulomas periapicais (GPs), cistos radiculares (CRs) e cistos radiculares residuais (CRRs), correlacionando-as com parâmetros morfológicos (intensidade do infiltrado inflamatório e padrão de revestimento epitelial). Amostra composta por 20 GPs, 20 CRs e 20 CRRs foi submetida à imunoistoquímica. As células inflamatórias e epiteliais foram quantificadas à partir da imunoexpressão nuclear e/ou citoplasmática/membranar e dados seus percentuais foram sumetidos à avaliação estatística. Os resultados para a avaliação morfológica revelaram que 100% dos GPs e 80% dos CRs apresentaram um intenso infiltrado inflamatório (grau III), e para os CRRs, 60% apresentaram um infiltrado inflamatório leve (grau I). Na análise do revestimento epitelial das lesões císticas, o padrão atrófico foi observado em 65% dos CRRs e 50% dos CRs, já o hiperplásico, em 50% dos CRs e 35% dos CRRs. A avaliação imunoistoquímica de cada galectina no componente conjuntivo, demonstrou que os GPs apresentaram uma maior expressão da galectina -1 em relação aos CRs e CRRs tanto no núcleo quanto no componente citoplasmático/membranar das células inflamatórias (p< 0,05). Adicionalmente, as lesões que apresentaram inflamação grau III tiveram uma maior expressão da galectina-1 em ambos componentes celulares (p<0,05). A galectina-3 não demonstrou diferenças estatisticamente significativas nas células inflamatórias do componente conjuntivo (p> 0,05). Para a galectina-7, os GPs apresentaram uma maior imunoexpressão desta proteína no componente citoplasmático/membranar, comparadas aos CRs e CRRs (p<0,05) e independente do tipo de lesão, as que apresentaram infiltrado inflamatório grau III tiveram maior imunoexpressão da galectina-7 (p<0,05). No componente epitelial, as galectinas -1 e -3 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas de imunoexpressão (p> 0,05). Todavia, a imunoexpressão da galectina-7 revelou que o revestimento epitelial de CRRs apresentaram um maior percentual de positividade nuclear quando comparado ao revestimento dos CRs (p = 0,014). Lesões com epitélio hiperplásico exibiram maior positividade citoplasmática/ membranar quando comparadas às de epitélio atrófico (p=0,020). Foram observadas correlações positivas para cada uma das galectinas no componente epitelial e conjuntivo de todas as lesões. Adicionalmente, foram observadas correlações positivas entre as galectinas -1 e -7 no tecido conjuntivo (p < 0,001), independente do tipo de lesão. Em conclusão, os resultados do presente estudo evidenciam a participação destas proteínas na modulação da resposta imunoinflamatória entre lesões periapicais.