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Previous issue date: 2014-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Polyamines are aliphatic organic bases belonging to the group of bioactive amines that have important metabolic and physiological functions in animals, plants and microorganisms. Amongst the most important polyamines biologically are spermidine [N-(3-aminopropyl) -1,4-butane diamine or tetramethylene diamine-aminopropyl] (SPD) and spermine [N, N'-bis (3-aminopropyl) -1,4-butane diamine or diaminopropil-tetramethylethylenediamine] (SPM). Polyamines are intimately involved in the growth and replication of many cell types, and it has been demonstrated that they are found in high concentrations in rapid growing cells. It is possible that substances such as naphthoquinones, which can react with polyamines have the ability to block its function by depleting its concentration. The direct detection of polyamines by HPLC with UV detection is hampered because they lack structural groups with high molar absorptivity. Thus, the objective of this study was to develop and validate a chromatographic method using fluorescence detection that could be applied for quantifying the cellular levels of polyamines in cell cultures based on the following parameters: selectivity, linearity, precision and accuracy. The polyamines were derivatized pre-column with dansyl chloride and were detected by fluorescence (ex= 365 nm; em= 510 nm) using a chromatographic method using gradient elution with a mobile phase consisting of methanol: water (35-95 v/v), a reversed-phase C18 column (250 x 4.6 mm, 5μm) at a flow rate of 1.0 mL/min., in 35 minutes. The chromatographic method was validated according to Resolution 899 recommended by the National Sanitary Agency of Brazil (ANVISA), and was linear in the concentration range used for SPD (0.0097 to 0.97 pmol/mL) and SPM ( 0.074 to 0.74 pmol/mL), precise (≤ 15% for medium and high concentrations, ≤ 20% for the low concentration), exact for SPD (97-118%) and SPM (92-119%), It also showed selectivity (demonstrated by separation of polyamines and proteins present in cell culture medium). The developed method was also applied to the analysis of polyamines incubated with the naphtoquinones (lapachol and β-lapachone). The concentration of these polyamines was depleted when incubated for 17 hours at ambient temperature (decrease of 67% and 50% for SPD and SPM levels respectively when incubated with lapachol and a decrease of 44% and 37,5% for SPD eand SPM when incubated with β-lapachona). These results demonstrate that the developed method is adequate for the analysis of polyamines in cell culture and that a probable mechanism of antitumoral action for the naphtoquinones may involve the formation of adducts with polyamines / Poliaminas são bases orgânicas alifáticas pertencentes às aminas bioativas que desempenham importantes funções metabólicas e fisiológicas em animais, vegetais e microrganismos. As mais importantes biologicamente são a espermidina [N-(3-aminopropil)-1,4-butano diamina ou aminopropil-tetrametilenodiamina] (SPD) e a espermina [N,N -bis(3-aminopropil)-1,4-butano diamina ou diaminopropil-tetrametilenodiamina] (SPM). Estão intimamente envolvidas no crescimento e replicação de diversos tipos de células, e em especial encontra-se em altas concentrações em células exibindo crescimento rápido. É possível que substâncias tais como as naftoquinonas, que possam reagir com as poliaminas, tenham a capacidade de bloquear as suas funções pela depleção de sua concentração. A sua detecção direta é dificultada por não possuírem grupos que apresentam alta absortividade molar. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e validar um método cromatográfico, utilizando detecção por fluorescência que possa ser aplicado a quantificação do nível celular de poliaminas em cultura de células tumorais com base nos seguintes parâmetros: seletividade, linearidade, precisão e exatidão e investigar a formação de adutos com naftoquinonas. Para tanto derivatizou-se as poliaminas fora do sistema cromatográfico (pré-coluna) com cloreto de dansila, formando derivados dansilados que foram detectados por fluorescência (ex= 365 nm; em= 510 nm). A separação se deu por eluição em modo gradiente, utilizando como fase móvel metanol:água (35-95 v/v), uma coluna de fase reversa C-18 (250 x 4,6 mm, 5μm) a um fluxo de 1,0 mL/min, em 35 minutos. O método cromatográfico desenvolvido foi validado segundo o preconizado na Resolução 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e mostrou-se sensível, linear na faixa de concentração utilizada para SPD (97-970 pmol/mL) e para SPM (74-740 pmoL/mL), preciso (≤ 15% para as concentrações média e alta; ≤ 20% para a concentração baixa), exato para SPD (91-112%) e para SPM (92-119%), mostrando-se também seletivo (frente a separação das poliaminas e as proteínas presentes no meio de cultivo celular). O método desenvolvido foi ainda aplicado à análise das poliaminas incubadas com as naftoquinonas (lapachol e β-lapachona), e observou-se que a concentração dessas aminas foi depletada quando incubadas por 17 horas a temperatura ambiente com as naftoquinonas (diminuição de 67% e 50% dos níveis de SPD e SPM respectivamente quando incubadas com o lapachol; e diminuição de 44% e 37,5% de SPD e SPM quando incubadas com β-lapachona). Esses resultados mostram que o método desenvolvido é adequado para análise de poliaminas em cultura de células tumorais e que um provável mecanismo de ação antitumoral das naftoquinonas pode envolver a formação de adutos entre estas e as poliaminas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.biblioteca.ufpb.br:tede/6800 |
| Date | 28 March 2014 |
| Creators | Figueiredo, Eugenia Abrantes de |
| Contributors | Oliveira, Eduardo de Jesus |
| Publisher | Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, UFPB, BR, Farmacologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFPB, instname:Universidade Federal da Paraíba, instacron:UFPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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