Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist der Prototyp einer systemischen Autoimmunkrankheit, bei dem neben leichteren Verläufen mit spontan remittierendem Hautausschlag und Gelenkschmerzen häufig eine Nierenbeteiligung in Form der Glomerulonephritis vorkommt. Eine weitere Autoimmunerkrankung ist das Sjögren-Syndrom, bei der exokrine Drüsen befallen werden und v. a. zu anhaltender Mund- und Augen-trockenheit führen. Beide Erkrankungen gehören zu den Kollagenosen (Bindegewebs-erkrankung), bei denen organunspezifische Autoantikörper gegen Zellkernmaterial (anti-nukleäre Antikörper) zur Diagnosefindung beitragen. Eines der Antigene nennt sich La/SS-B (Sjögren-Syndrom-B), es wird bei 70 % der Sjögren-Syndrom- und 25 % der SLE-Patienten registriert. Im Rahmen von Zelluntergang wie bei Infektionen oder UV-Licht-Exposition, wenn La/SS-B extrazellulär für das Immunsystem zugänglich wird, kommt es zu Krankheitsschüben von SLE. La/SS-B ist bei fast allen Eukaryonten ein essentielles Kernprotein, das Nukleinsäuren, v. a. RNA, und in gewissem Grad auch DNA binden kann. Beim Menschen hat es eine wichtige Funktion in der Bindung von RNA-Polymerase III-Transkripten. Das Protein besteht funktionell aus einem N- und einem C-Terminus. Der N-Terminus beinhaltet das La-Motiv und das RRM1 (RNA recognition motif 1, RNA-Erkennungmotiv). Es kann davon ausgegangen werden, dass im Rahmen der Erkrankungen in einer oder mehrerer Phasen dendritische Zellen des Immunsystems mit dem Protein in Kontakt treten, da diese zentralen Zellen des Immunsystems für die Bildung von Antikörpern essenziell sind. 6 sulfo LacNAc+ dendritische Zellen (slanDC) sind die proinflammatorische Hauptpopulation myeloider dendritischer Zellen (mDC) und produzieren bei Stimulation große Mengen Tumornekrosefaktor α (TNF α). Sie besitzen wie alle mDCs keinen TLR9 (toll-like receptor, Toll-ähnlicher Rezeptor), der durch CpG-reiche, bakterielle DNA aktiviert würde, dafür aber solche TLRs, die zu einer Aktivierung der slanDCs u. a. durch bakterielle RNA oder Lipopolysaccharide (LPS) führen.
Eine entscheidende Frage ist, warum es zur Bildung von Autoantikörpern gegen das Kern- und RNA-Bindeprotein La kommt und ob La-Autoantikörper eine Begleiterscheinung sind oder ob es tatsächlich immunstimulierende Formen von La gibt. Da La ein Nukleinsäure-bindendes Protein ist, ist eine Assoziation mit bakteriellen Nukleinsäuren nach prokaryontischer Herstellung wie in dieser Arbeit wahrscheinlich. Da der N-Terminus des La-Proteins die RNA-Bindedomäne enthält, wurde dieser näher untersucht. Die Stimulierbarkeit von DCs durch La ist noch unzureichend erforscht. In dieser Arbeit wurde repräsentativ die Stimulierbarkeit von slanDCs durch La/SS-B nach Aufreinigung durch zwei variierende Verfahren untersucht. Zu prüfen war, ob und in welchem Umfang die gebundenen Nukleinsäuren Einfluss auf die Aktivierungsfähigkeit haben.
La-Protein wurde prokaryontisch rekombinant in E. coli-Bakterien hergestellt und mit Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Durch Einbau eines Stopcodons konnte zusätzlich der N-terminale Teil von La (LaN) separat hergestellt werden. Bei einer erneuten Aufreinigung wurde das Aufreinigungsverfahren um einen DNase-/RNase-Verdau erweitert. Um gebundene Nukleinsäuren nachzuweisen und zu messen wurden UV-Spektren der aufgereinigten Proteine bei 220–300 nm angefertigt. Zudem erfolgten Fluoreszenzfärbungen mit RiboGreen®, welches auf Nukleinsäuren reagiert. Für verschiedene Referenzversuche und Vergleiche wurden E. coli- und eukaryontische RNA mit TriPure Isolation Reagent und Chloroform isoliert. Die slanDCs wurden über magnetischer Zellseparierung aus PBMCs isoliert, die zuvor aus buffy coats mittels Ficoll-Dichtezentrifugation gewonnen wurden. Sie wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden kultiviert, die Probenzugabe erfolgte 4 Stunden nach Kulturbeginn. Im Überstand wurde die TNF α-Konzentration mittels ELISA bestimmt.
Nach erfolgter Aufreinigung bestätigten Westernblots die Identität der Proteine La und LaN. Die UV-Spektren ergaben Protein-Nukleinsäure-Mischspektren, der Nukleasen-verdau verringerte jedoch den gebundenen Nukleinsäure-Anteil. RiboGreen®-Probefärbungen verschiedener Nukleinsäuren sowie Verdauungsversuche mit Nuklease zeigten eine Inhomogenität der Fluoreszenzintensitäten abhängig von der Art und Länge der Nukleinsäure. Dadurch war eine korrekte Quantifizierung des La-gebundenen bakteriellen Nukleinsäure-Gemischs nicht möglich. Trotzdem konnte beim getrennten Verdau mit DNase und RNase die Nukleinsäure an La-Protein als größtenteils RNA, an LaN als fast ausschließlich RNA identifiziert werden. In den slanDC-Aktivierungsversuchen erwiesen sich sowohl 5 pmol La-Volllänge als auch 5 pmol von dessen seperatem N-Terminus als potente Stimulatoren. Die Nuklease-verdauten Varianten von La und LaN waren signifikant weniger immunstimulierend. Selbst 50 pmol Nuklease-behandeltes La führten zu weniger TNF α-Produktion als 5 pmol unbehandeltes La. In einem Kontrollversuch war aufgereinigter E. coli-RNA ebenfalls stimulierend, eukaryontische RNA hingegen nicht. CpG-DNA führte ebenfalls zu keiner Aktivierung von slanDCs. Reassoziationsversuche von Nuklease-behandeltem N-terminalen La-Protein mit eukaryontischer RNA konnten keine immunstimulierende Wirkung hervorrufen.
Es kann aus den Versuchen mit slanDCs geschlossen werden, dass an La gebundene bakterielle Nukleinsäuren für die Aktivierung der Immunzellen hauptverantwortlich waren. Mit großer Wahrscheinlichkeit beruht die Aktivierung auf RNA. Einerseits wurde v. a. RNA in den Proteinaufreinigungen nachgewiesen, andererseits tragen mDCs keinen TLR9 zur DNA-Erkennung. Diese Arbeit wirft die Frage auf, ob dem Protein La/SS B eine Funktion als Alarmin innewohnt, ähnlich dem Protein LL 37, das selbst das Immunsystem nicht stimuliert, aber körpereigene DNA komplexieren und dadurch in eine autostimulierende Form verwandeln kann. Möglicherweise wird durch Zellschaden freigewordenes La durch gleichzeitig vorhandene körperfremde Nukleinsäuren in Immunzellen geschleust, um auf diesem Weg die Immuntoleranz zu durchbrechen. Nachdem in dieser Arbeit offenbar die Nukleinsäuren für die Aktivierung von slanDCs verantwortlich waren, könnte in weiterführenden Versuchen an isolierten T Helferzellen oder an murinen T-Zellen in vivo untersucht werden, ob sie durch Stimulation mit La-aktivierten DCs tatsächlich auf La-Protein geprimt (priming, Prägung) werden. Zudem wird die Vermutung aufgeworfen, ob extrazelluläres La während einer bakteriellen Infektion deren Nukleinsäuren stabilisiert und vor Nukleasen schützt. Dadurch vermehrt auftretende extrazelluläre bakterielle Nukleinsäure könnte einen SLE-Schub auslösen, was für SLE charakteristisch wäre.:Inhaltsverzeichnis 3
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 8
Abkürzungsverzeichnis 9
1. Einleitung 13
1.1 Das menschliche Immunsystem 13
1.1.1 Die zentrale Rolle dendritischer Zellen bei der Einleitung der Immunantwort 14
1.1.2 Die besondere Rolle dendritischer Zellen bei der spezifischen Immunantwort 15
1.1.3 SlanDCs, eine neue Gruppe dendritischer Zellen 17
1.1.4 Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems 18
1.2 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) 18
1.2.1 Allgemeines und Epidemiologie 18
1.2.2 Aspekte zur Pathogenese 20
1.3 Das Autoantigen La/SS B 23
1.4 Die Rolle von Nukleinsäuren bei autoimmunen Prozessen 26
1.5 Zielstellung 28
2. Materialien 30
2.1 Chemikalien und Reagenzien 30
2.2 Puffer und Lösungen 31
2.3 Medien 33
2.4 Bakterienstamm 33
2.5 Zelllinien 34
2.6 DNAs und RNAs 34
2.7 Enzyme 34
2.8 Antikörper 35
2.9 Molekulargewichtsmarker 35
2.10 Kitsystem 36
2.11 Verbrauchsmaterialien 36
2.12 Geräte und Software 36
3. Methoden 39
3.1 Molekularbiologische Methoden 39
3.1.1 Arbeiten mit Bakterien 39
3.1.1.1 Kultivierung von Bakterien für die prokaryotische Proteinproduktion 39
3.1.1.2 Bestimmung der OD600 40
3.1.2 Herstellung von RNA-Totalextrakten 40
3.1.2.1 RNA aus E. coli 40
3.1.2.2 RNA aus eukaryontischen Zellen 41
3.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 41
3.1.4 Bestimmung des Nukleinsäure-Gehalts mit RiboGreen® RNA Quantification Kit 41
3.2 Zellbiologische Methoden 43
3.2.1 Kultivierung von Raji- und U937-Zellen 43
3.2.2 Isolierung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus buffy coats 43
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 44
3.2.4 Isolierung von slanDCs aus PBMCs 44
3.2.5 Durchflusszytometrie 44
3.2.5.1 Messung der Reinheit der slanDCs 45
3.2.5.2 Untersuchung von Oberflächenmarkern auf slanDCs 46
3.3 Proteinbiochemische Methoden 46
3.3.1 Aufreinigung der prokaryontisch produzierten Proteine 46
3.3.2 Dialyse 48
3.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen 48
3.3.4 Spektralanalyse von Protein-Lösungen und von DNA 48
3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 48
3.3.6 Coomassiefärbung von SDS-Gelen 50
3.3.7 Konzentrationsbestimmung mit Proteinstandard im SDS-Gel 50
3.3.8 Western Blotting und Immundetektion 50
3.3.9 Aktivierungsversuche von slanDCs durch Zugabe von La 51
3.3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 51
4. Ergebnisse 53
4.1 Herstellung des Proteins La und dessen N-terminaler Domäne 53
4.2 Charakterisierung der Proteine und Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts 56
4.2.1 Westernblots und Färbung mit verschiedenen Antikörpern 56
4.2.2 Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts in La und LaN mittels UV-Spektrum 57
4.2.3 Quantifizierung und Differenzierung der an La gebundenen Nukleinsäuren mit RiboGreen® 63
4.3 Aktivierungsversuche mit slanDCs, der Hauptpopulation von mDCs 67
4.3.1 La und slanDCs 68
4.3.2 Immunstimulierende Kapazität von bakteriell exprimiertem La nach RNase- und DNase-Behandlung 72
4.3.3 Das Teilprotein LaN (N-terminale Domäne von La) 76
4.3.4 Die Reaktion von slanDCs auf eukaryontische und prokaryontische RNA sowie CpG-DNA 79
5. Diskussion 83
5.1 Erläuterungen zur Herstellung der Proteine La und dessen N-terminaler Domäne 83
5.2 Ist an bakteriell gewonnenem La-Protein Nukleinsäure gebunden? 84
5.3 SlanDCs werden durch La-Protein aktiviert, wenn bakterielle Nukleinsäure gebunden ist 87
6. Zusammenfassung 91
Summary 94
Literaturverzeichnis 97
Danksagung 107
Anlagen 109 / Systemic lupus erythematosus (SLE) is the prototype of a systemic autoimmune disease. Apart from a spontaneously remitting rash and joint pain a glomerulonephritis often damages the kidney. Sjögren’s syndrome is another autoimmune disease. It affects the exocrine glands whose destruction leads to persistent mouth and eye dryness. Both diseases belong to the group of collagenoses (connective tissue diseases) where organ non specific autoantibodies against nuclear material (antinuclear antibodies) are used for diagnosis. One antigen called La/SS-B (Sjögren’s Syndrome-B) has been detected in seventy percent of the patients with Sjögren’s syndrome and in twenty-five percent of the patients with SLE. On cell death, for example due to infections or exposure of UV light, La/SS-B is exposed to the extracellular space becoming available to the immune system and leads to an exacerbation of SLE. La/SS-B is an essential nuclear protein in almost all eukaryotes. It binds nucleic acids, particularly RNA, but also DNA to a lesser extent. A major function in humans is the binding of RNA polymerase III transcripts. The protein can be divided into an amino- and a carboxyl-terminus, each serving a different function. The amino-terminus contains the La motif and the RRM1 (RNA recognition motif 1). In one or more phases during the disease La/SS-B will interact with dendritic cells (DC). These central cells of the immune systems are essential for the generation of an antibody response. 6 sulfo LacNAc+ dendrite cells (slanDC) are the major population of myeloid dendritic cells (mDC) and have a high proinflammatory potential. In case of stimulation they produce large amounts of tumor necrosis factor α (TNF α). Like all mDCs they have no TLR9 (toll-like receptor), which could activate the slanDCs via bacterial DNA, but they have TLRs that activate these cells by bacterial RNA and lipopolysaccharide (LPS).
A crucial question is why autoantibodies against the nuclear RNA binding protein La are generated. These autoantibodies could be the consequence of an epiphenomenon or of active immunostimulation. Because La is a nucleic acid binding protein, an association with bacterial nucleic acids after purification from transformed prokaryotes seemed possible. The amino-terminus was analyzed closer since in contains the RNA binding domain. The stimulation of DCs is still insufficiently researched. In this dissertation the stimulation of slanDCs by La/SS-B after purification, using two different methods, was studied. The goal was to clarify whether the bound nucleic acids have an effect on the activation ability of La/SS-B.
La protein was produced recombinantly in E. coli bacteria and purified with nickel affinity chromatography. It was possible to create and purify the separate amino-terminus of La (LaN) by insertion of a stop codon in the transformed prokaryotic DNA. In a second purification of La and LaN the procedure was supplemented by a treatment with DNase and RNase. An UV spectral analysis at 220–300 nm was performed to verify and measure bound nucleic acid of the purified proteins. Furthermore RiboGreen®, which reacts to nucleic acids, was used for fluorescence staining. E. coli and eukaryotic RNA were isolated with TriPure Isolation Reagent and Chloroform for several experiments and comparisons. The slanDCs were isolated by magnetic cell isolation from PBMCs which were obtained from buffy coats by Ficoll density centrifugation. The DCs were cultivated for 24 hours at room temperature and the samples were added 4 hours into the process. In the supernatant the TNF α concentration was measured by ELISA.
After protein purification, western blots were used to verify the identity of La and LaN. The UV spectral analysis showed mixed spectra of proteins and nucleic acids, however the treatment with nucleases reduced the amount of nucleic acids bound to the proteins. RiboGreen® fluorescence staining of various nucleic acids and digestion experiments with nucleases reveal an inhomogeneous fluorescence depending on the type and length of the nucleic acid. This made it impossible to quantify the correct amount of the La-bound bacterial nucleic acid mixture. With the use of a separate treatment with either DNase or RNase the biggest part of the nucleic acid bound to La could be identified as RNA. For LaN this was almost exclusively RNA. 5 pmol La as well as its amino-terminus LaN proved to be potent stimulators in the activation experiment of slanDCs. The nuclease-treated protein variants of La and LaN were significantly less immunostimulatory. Even 50 pmol nuclease-treated La led to less TNF α production than 5 pmol untreated La. E. coli RNA was equally stimulatory to slanDCs in the control experiment. The same did not hold true for eukaryotic RNA. CpG DNA also did not lead to an activation of slanDCs well. The attempt to reassociate nuclease-treated LaN with eukaryotic RNA did not induce a conversion of LaN in an immunestimulatory activator for slanDCs.
It was shown that La-bound bacterial nucleic acids are mainly responsible for the activation of slanDCs. The activation seems to be triggered by the RNA. On one hand RNA was found to be large part of the purified proteins, on the other hand mDCs do not have a TLR9 for the recognition of DNA. This dissertation raises the question whether La/SS B has a role as an alarmin similar to the small protein LL 37, that could not stimulate the immune system itself, but complex the body’s own DNA and convert it to an autostimulatory form. Extracellular La from cell death might be taken up by DCs which are stimulated by foreign nuclein acids at the same time, leading to an immune response against La, too. Due to the observation that nucleic acids were responsible for the activation of slanDCs, further experiments with isolated T helper cells or murine T cells in vivo should be performed. These experiments should address questions whether La specific T cells, which are subsequently responsible for the activation of B cells, are primed. The results of this dissertation led to the assumption that extracellular La could potentially stabilize and protect bacterial nucleic acids during infections from nucleases. This increase of extracellular bacterial nucleic acids could trigger an exacerbation of SLE, which is typically observed in SLE.:Inhaltsverzeichnis 3
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 8
Abkürzungsverzeichnis 9
1. Einleitung 13
1.1 Das menschliche Immunsystem 13
1.1.1 Die zentrale Rolle dendritischer Zellen bei der Einleitung der Immunantwort 14
1.1.2 Die besondere Rolle dendritischer Zellen bei der spezifischen Immunantwort 15
1.1.3 SlanDCs, eine neue Gruppe dendritischer Zellen 17
1.1.4 Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems 18
1.2 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) 18
1.2.1 Allgemeines und Epidemiologie 18
1.2.2 Aspekte zur Pathogenese 20
1.3 Das Autoantigen La/SS B 23
1.4 Die Rolle von Nukleinsäuren bei autoimmunen Prozessen 26
1.5 Zielstellung 28
2. Materialien 30
2.1 Chemikalien und Reagenzien 30
2.2 Puffer und Lösungen 31
2.3 Medien 33
2.4 Bakterienstamm 33
2.5 Zelllinien 34
2.6 DNAs und RNAs 34
2.7 Enzyme 34
2.8 Antikörper 35
2.9 Molekulargewichtsmarker 35
2.10 Kitsystem 36
2.11 Verbrauchsmaterialien 36
2.12 Geräte und Software 36
3. Methoden 39
3.1 Molekularbiologische Methoden 39
3.1.1 Arbeiten mit Bakterien 39
3.1.1.1 Kultivierung von Bakterien für die prokaryotische Proteinproduktion 39
3.1.1.2 Bestimmung der OD600 40
3.1.2 Herstellung von RNA-Totalextrakten 40
3.1.2.1 RNA aus E. coli 40
3.1.2.2 RNA aus eukaryontischen Zellen 41
3.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 41
3.1.4 Bestimmung des Nukleinsäure-Gehalts mit RiboGreen® RNA Quantification Kit 41
3.2 Zellbiologische Methoden 43
3.2.1 Kultivierung von Raji- und U937-Zellen 43
3.2.2 Isolierung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus buffy coats 43
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 44
3.2.4 Isolierung von slanDCs aus PBMCs 44
3.2.5 Durchflusszytometrie 44
3.2.5.1 Messung der Reinheit der slanDCs 45
3.2.5.2 Untersuchung von Oberflächenmarkern auf slanDCs 46
3.3 Proteinbiochemische Methoden 46
3.3.1 Aufreinigung der prokaryontisch produzierten Proteine 46
3.3.2 Dialyse 48
3.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen 48
3.3.4 Spektralanalyse von Protein-Lösungen und von DNA 48
3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 48
3.3.6 Coomassiefärbung von SDS-Gelen 50
3.3.7 Konzentrationsbestimmung mit Proteinstandard im SDS-Gel 50
3.3.8 Western Blotting und Immundetektion 50
3.3.9 Aktivierungsversuche von slanDCs durch Zugabe von La 51
3.3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 51
4. Ergebnisse 53
4.1 Herstellung des Proteins La und dessen N-terminaler Domäne 53
4.2 Charakterisierung der Proteine und Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts 56
4.2.1 Westernblots und Färbung mit verschiedenen Antikörpern 56
4.2.2 Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts in La und LaN mittels UV-Spektrum 57
4.2.3 Quantifizierung und Differenzierung der an La gebundenen Nukleinsäuren mit RiboGreen® 63
4.3 Aktivierungsversuche mit slanDCs, der Hauptpopulation von mDCs 67
4.3.1 La und slanDCs 68
4.3.2 Immunstimulierende Kapazität von bakteriell exprimiertem La nach RNase- und DNase-Behandlung 72
4.3.3 Das Teilprotein LaN (N-terminale Domäne von La) 76
4.3.4 Die Reaktion von slanDCs auf eukaryontische und prokaryontische RNA sowie CpG-DNA 79
5. Diskussion 83
5.1 Erläuterungen zur Herstellung der Proteine La und dessen N-terminaler Domäne 83
5.2 Ist an bakteriell gewonnenem La-Protein Nukleinsäure gebunden? 84
5.3 SlanDCs werden durch La-Protein aktiviert, wenn bakterielle Nukleinsäure gebunden ist 87
6. Zusammenfassung 91
Summary 94
Literaturverzeichnis 97
Danksagung 107
Anlagen 109
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:30953 |
| Date | 03 April 2019 |
| Creators | Ludwig, Florian |
| Contributors | Bachmann, Michael, Schmitz, Marc, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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