\'Trypanosoma cruzi\' é o agente etiológico da doença de Chagas, esta considerada um problema de saúde pública na América Latina. Cerca de 10 a 14 milhões de pessoas estão infectadas com o \'Trypanosoma cruzi\' e 40120 milhões de pessoas correm o risco de contrair a doença. Diidroorotato desidrogenase (DHODH) é uma flavoenzima que catalisa a oxidação de L-diidroorotato em orotato, a quarta e única reação redox na biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidinas. Atualmente, existe um grande interesse em inibidores da DHODH como agentes terapêuticos para o tratamento de câncer, artrite reumatóide e doenças parasitarias. Em particular, estudos genéticos têm mostrado que DHODH é essencial para a sobrevivência do \'T. cruzi\', validando a idéia de que DHODH pode ser considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de drogas antichagásicas. Neste trabalho, reportamos a estrutura cristalográfica da enzima DHODH de \'Trypanosoma cruzi\' cepa Y (TcDHODH), uma cepa parcialmente resistente a drogas e altamente virulenta. O gene de TcDHODH que codifica um polipeptídeo consistindo de 314 aminoácidos foi clonado em pET-28a entre os sítios de restrição BamHI e NotI. A enzima TcDHODH foi expressa como uma proteína solúvel em E. coli BL21 (DE3) através da indução com 1 mM IPTG por 5 h a 25 °C e purificada utilizando cromatografia por afinidade em resina Ni-NTA. A cristalização de TcDHODH foi realizada utilizando o método de difusão de vapor em gotas suspensa e pendurada contra o reservatório contendo 1,5 M sulfato de amônio, 5% 2-propanol em 0,1 M acetato de sódio pH 5 adicionado de 2 mM ditiotreitol (DTT). A coleta de dados foi realizada na linha de luz D03B-MX1 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) com radiação a 1,427 Å. Cristais de TcDHODH difratam à resolução de 2.2 Å e crescem no grupo espacial P212121 com parâmetros de cela a = 82.39, b = 123.92 e c = 128.89 Å. A estrutura foi resolvida por técnicas de substituição molecular e refinada a 2.2 Å de resolução. Uma análise detalhada da enzima TcDHODH cepa Y tem nos permitido identificar características estruturais que podem ser melhor exploradas para o desenho de inibidores altamente específicos através da tecnologia de desenho de drogas baseado em estrutura, como uma importante ferramenta no combate a doença de Chagas. / \'Trypanosoma cruzi\' is the etiological agent of Chagasdisease, considered a public health problem in Latin America. Ten to 14 million people are infected by \'Trypanosoma cruzi\' and 40120 million people are at risk of infection. Dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) is a flavin mononucleotide containing enzyme, which catalyses the oxidation of L-dihydroorotate to orotate, the fourth step and only redox reaction in the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. At present, there is a great interest in inhibitors of DHODH as therapeutic agents for the treatment of cancer, rheumatoid arthrits and parasitic diasease. In particular, genetic studies have shown that DHODH is essential for \'T. cruzi\' survival, validating the idea that DHODH can be considered an attractive target for the development of antichagasic drugs. Here, we report the crystal structure of \'Trypanosoma cruzi\' DHODH from Y strain (TcDHODH), a partially drug-resistant and highly virulent strain. The TcDHODH gene that encodes a polypeptide consisting of 314 amino acid residues was cloned into BamHI and NotI restriction sites of pET-28a. The TcDHODH was functionally expressed as a soluble protein in E. coli BL21 (DE3), through induction with 1 mM IPTG for 5 h at a temperature of 25 °C and purified to homogeneity using affinity chromatography on Ni-NTA resin. The crystallization of TcDHODH was performed using vapor diffusion method in sitting and hanging drops against a reservoir solution containing 1.5 M ammonium sulfate, 5% 2-propanol in 0.1 M sodium acetate pH 5 plus the addition of 2 mM dithiothreitol (DTT). Data collection was performed at the D03B-MX1 beam line of the Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS) using 1.427 Å radiation. TcDHODH crystals diffract up to 2.2 Å resolution and belong to space group P212121 with unit cell dimensions a = 82.39, b = 123.92 and c = 128.89 Å. The structure has been solved by molecular replacement techniques and refined up to 2.2 Å resolution. A detailed analysis of TcDHODH strain Y has allowed us to identify structural characteristics that can be further exploited for design of highly specific inhibitors through the technology of structure-based drug design as an important tool to fight against Chagasdisease.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16122010-153549 |
| Date | 29 February 2008 |
| Creators | Pinheiro, Matheus Pinto |
| Contributors | Costa, Maria Cristina Nonato |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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