ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam o ATP e o ADP a AMP e Pi e estão envolvidos em inibição da agregação plaquetária. No parasita Schistosoma mansoni nosso grupo identificou e clonou o gene da ATPDase1, e a proteína foi localizada na superfície do tegumento. Recentemente, clonamos o gene da ATPDase2 usando a informação do banco de dados de ESTs de S. mansoni e imunolocalizamos a sua proteína também no tegumento. ATPDase2 foi encontrada em ambas as membranas do tegumento basal e apical juntamente com a ATPDase1, entretanto ATPDase2 somente foi encontrada no espaço sincicial do tegumento. A presença de ambas as enzimas sobre a superfície externa do tegumento sugere um maior papel sobre a regulação de abundância de nucleotídeos. Análise da expressão de ambos os genes foram realizadas por RT- PCR em tempo real usando RNA de ovos, miracídeo, cercária, esquistossômulo e verme adulto. Os resultados mostraram que o gene da ATPDase1 foi mais expresso em ovos (7 vezes), adulto (6 vezes), cercária (3,5 vezes) e esquistossômulo (1,5 vezes) quando comparado ao miracídio, que foi tomado como referência. O gene da ATPDase2 foi mais expresso em ovos (16 vezes), cercária (11 vezes), miracídio (7 vezes) e verme adulto (2 vezes) quando comparado a esquistossômulo, mostrando que ambos os genes são modulados ao longo de seus estágios de ciclo de vida . Para maior caracterização destas enzimas, elas foram expressas heterologamente na levedura Pichia pastoris como proteínas de fusão com cauda de 6 histidinas e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade com resina de Ni-NTA. As ATPDases recombinantes foram obtidas de forma ativa e medições de atividade enzimática foram realizadas. ATPDase1 - mostrou atividades ATPásica e ADPásica em torno de 650 e 160 nmoles Pi.min -1. mg-1 , respectivamente. ATPDase2 teve atividades ATPásica e ADPásica na faixa de 1050 e 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectivamente. Adicionalmente, atividades UTPásica e UDPásica também foram encontradas nestas enzimas. Estudos de dicroísmo circular com estas duas enzimas elucidaram suas estruturas secundárias. Com isto, ATPDase1 (S66 to Q507 ) teve alfa-hélice (7 %), folha-beta (45 %) e estrutura randômica (48 %), e a ATPDase2 (N83 a K564 ) mostrou conter alfa-hélice (14 %), folha-beta (33 %) e estrutura randômica (53 %). Nós mostramos que a ATPDase2 é secretada pelo parasita no meio, de forma similar como descrito para as ATP-difosfohidrolases humanas CD39L2 e CD39L4. Adicionalmente, em ensaios de inibição de penetração (cercária em camundongo) usando anticorpo anti- ATPDase1 foi mostrada uma redução em 20 % da capacidade de penetração através da pele das cercárias previamente incubadas com o anti-soro. Devido a que a expressão do gene da ATPDase2 estava mais alta em miracídio e cercária, estágios que infectam caramujos e humanos, respectivamente, postulamos que ATPDase2 poderia ajudar no processo de invasão do parasita. No estágio ovo ambos os genes estão altamente expressados sugerindo um possível envolvimento das ATPDases na resposta de proteção contra o sistema imune humano. Ensaios de proteção contra S. mansoni em camundongos, usando as ATPDases 1 e 2 como antígenos, resultaram em uma baixa proteção obtendo-se não mais que 20% na redução da carga parasitária. / ATPDases or ATP-diphosphohydrolases are enzymes that cleave ATP and ADP to AMP and Pi and are involved in inhibition of platelet aggregation. In the parasite Schistosoma mansoni our group had identified and cloned the ATPDase1 gene and localized the protein on the tegument surface. Recently, we cloned the ATPDase2 gene using S. mansoni EST databank information and we immunolocalized it also in the tegument. ATPDase 2 was found on both the apical and basal tegument membranes together with ATPDase1, but only ATPDse2 was found in the syncytium space of the tegument. The presence of both enzymes on the tegumental outer surface suggests a major role in regulation of nucleotides abundance. Expression analysis of both genes was performed by Real Time RT- PCR using RNA from eggs, miracidia, cercariae, schistosomula and adult worms. The results showed that ATPDase1 gene was more expressed in eggs (7-fold), adults (6-fold), cercariae (3.5-fold) and schistosomula (1.5-fold) when compared to miracidia, which was taken as the reference. ATPDase2 gene was more expressed in eggs (16-fold), cercariae (11-fold), miracidia (7-fold) and adult worms (2-fold) when compared to schistosomula, showing that both genes are modulated along the life cycle stages. For further characterization of these enzymes, they were expressed heterologously in the yeast Pichia pastoris as fusion proteins with hexa-histidine tags and the recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant ATPDases were obtained in active form and activity measurements were performed. ATPDase1 did show ATPase and ADPase activities about 650 and 160 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. ATPDase2 had ATPase and ADPase activities in the range of 1050 and 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. These results were obtained in the presence of calcium as cofactor. Additionally, UTPase and UDPase activities were found for both enzymes. Circular dichroism studies with these enzymes elucidated their secondary structures; ATPDase1 (S66 to Q507 ) has alpha helix (7%), beta sheet (45%) and random coil (48%), whereas ATPDase2 (N83 a K564 ) showed alpha helix (14%), beta sheet (33%) and random coil (53%). We found that ATPDase2 was secreted by the parasite to the medium, similar to what has been described for human CD39-L2 and CD39-L4 ATP-diphosphohydrolases. Additionally, a penetration assay (cercaria to mice) using antibody anti-ATPDase1 did show a decrease of 20% in the penetration capacity through mice skin of cercaria previously incubated with this antiserum. Because ATPDase2 gene expression was increased in miracidia and cercariae, the stages that infect snail and human, respectively, we postulate that ATPDase2 may help the parasite\'s invasion process. In the egg stage both genes were highly expressed suggesting a possible involvement of the ATPDases in the protection response of eggs against the human immune system. Assays of protection against S. mansoni in mice, using recombinant ATPDase1 and 2 as antigens, resulted in low protection obtaining no more than 20% of parasite burden reduction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-31032008-074222 |
| Date | 19 February 2008 |
| Creators | Garcia, Julio Cesar Levano |
| Contributors | Almeida, Sérgio Verjovski de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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