Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo9607_1.pdf: 2409888 bytes, checksum: e24bbd822c60f134a89b1cab6d11af3a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2001 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Vários polissacarídeos têm sido classificados como modificadores da resposta biológica. Seus efeitos biológicos especialmente suas atividades anti-tumoral e anti-microbiana, são consideradas como uma conseqüência deste fato. O heteropolissacarídeo extraído da goma de Anacardium occidentale (P JU) é composto por Gal, Ara,Glc, Rha, Xyl e Glc A, em uma proporção molar dc 82:4:6:2:l:5 e sua atividade anti-tumoral in vivo, e in vitro foi previamente demonstrada. A encapsulação em lipossomas tem sido utilizada para potencializar a atividade biológica de fármacos. O objetivo deste trabalho foi elaborar uma formulação de lipossomas contendo P JU e avaliar seu efeito frente ao sarcoma I80 e à infecção experimental pelo S. mansoni. Quinze formulações foram desenvolvidas de acordo com o método de evaporação de fase reversa modificado proposto por Amselem et al.,1990. Estas foram submetidas a testes de estabilidade acelerada e em longo prazo. A taxa de encapsulação do P JU foi calculada através do método de fenol sulfúrico. Obteve-se uma formulação estável positivamente carregada, constituída por fosfatidilcolina, colesterol e estearilamina (7:2:l). A fase aquosa utilizada foi P JU 2,5 mg.rnl-1, em solução tampão fosfato de sódio a 0,2 M, pH 7,4. Esta formulação demonstrou estabilidade até 90 dias. A toxicidade in vivo foi avaliada tratando-se camundongos (n=1O/grupo), via i.p., com P JU livre e encapsulado usando NaCl 150 mnM e lipossomas vazios como controles. A análise histopatológjca do fígado e do baço foi realizada e nenhuma alteração foi observada. A atividade anti-tumoral in vivo foi testada em camundongos usando o Sarcoma 180 como modelo. Em dose única, via i.p., o P JU livre e encapsulado em lipossomas (100 mg.Kg-1) não inibiu o crescimento do tumor. Estas preparações foram também testadas frente a camundongos infectados pelo S. mansoni por via caudal utilizando-se 150 cercárias/animal e tratados com dose única, i.p., das formulações (NaCl 150mM, lipossomas vazios, P JU livre e encapsulado em lipossomas), 24 horas e no 42º dia após a infecção. A evolução temporal da infecção foi avaliada pela presença de ovos do S. mansoni nas fezes de acordo com o método de Kato-Katz, após o 38º dia. Os animais foram sacrificados no 56º dia e a perfusão pelo sistema porta-hepático foi realizada. O P JU livre reduziu a eliminação de ovos em 19,6 e 58%, para o tratamento realizado 24 h e no 42º dia após a infecção, respectivamente. O P JU encapsulado em lipossomas causou uma redução de 82,1 e 88,1%, para as mesmas condições experimentais respectivamente. Estes resultados sugerem que P JU encapsulado' em lipossomas pode ser uma nova possibilidade terapêutica para o tratamento da infecção pelo S. mansoni, considerando sua estabilidade e ausência de toxicidade in vivo

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-12T17:32:30Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Luciana Santos Cardoso.pdf: 5958883 bytes, checksum: 032370973ff19d5545228b830334d728 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-12T17:32:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_Luciana Santos Cardoso.pdf: 5958883 bytes, checksum: 032370973ff19d5545228b830334d728 (MD5) / A prevalência das doenças alérgicas vem aumentando nas últimas três décadas, representando um grande problema de saúde pública. A infecção pelo Schistosoma mansoni tem sido associada com a proteção contra alergias. Os mecanismos envolvidos nesta associação incluem a produção de células e citocinas regulatórias. Objetivo: Avaliar a resposta imune induzida pelos antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 in vitro em células de indivíduos asmáticos e em modelo experimental de asma induzida por OVA. Métodos: Células mononucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos asmáticos não infectados foram estimuladas in vitro com Sm22.6, PIII e Sm29 para caracterizar o perfil de citocinas induzido por estes antígenos. A frequência de células produtoras de IL-10 e a habilidade destes antígenos em modularem a resposta do tipo Th2 alérgeno-específica foram também avaliadas. As citocinas foram mensuradas em sobrenadantes pela técnica de ELISA e os fenótipos das células produtoras de IL-10 foram determinados usando citometria de fluxo. Para o estudo experimental, foi utilizado o modelo de asma induzido por ovalbumina (OVA). Os camundongos receberam três doses dos diferentes antígenos do S. mansoni. A histopatologia e a atividade da peroxidase eosinofílica do pulmão foram avaliadas, assim como a celularidade no lavado brônquio-alveolar (BAL) e os níveis séricos de IgE e de citocinas no BAL. Adicionalmente, foi avaliada a frequência de células TCD4+ expressando Foxp3+ e IL-10+ em culturas estimuladas com OVA. Resultados: Foi observado uma alta produção de IL-10 por células de indivíduos asmáticos não infectados em resposta aos antígenos Sm22.6, PIII e Sm29 (451 ± 350 pg/mL, 364 ± 289 pg/mL e 712 ± 368 pg/mL, respectivamente), comparados às culturas não estimuladas. Não houve diferença significativa nos níveis de IFN-g, IL-5 e IL-13 após estímulo com os diferentes antígenos. As células CD4+CD25+ e CD14+ foram as principais fontes de IL-10 nas culturas estimuladas com os antígenos do S. mansoni. Além disso, a adição destes antígenos às culturas estimuladas com Der p1 levou a um aumento significativo nos níveis de IL-10 (p<0,0001 para todos os antígenos) e redução nos níveis de IL-5 (p<0,05 para culturas estimuladas com Der p1 e Sm22.6 ou Sm29, comparadas com Der p1 apenas). No modelo murino de asma a imunização com Sm22.6, PIII e Sm29 levou a uma redução no número de células totais e eosinófilos no BAL e nos níveis de IgE específica para OVA, comparados aos camundongos não imunizados. Adicionalmente, os níveis de IL-4 e IL-5 no BAL dos camundongos imunizados com PIII e Sm22.6 foram diminuídos, enquanto que os níveis de IL-10 foram maiores em camundongos imunizados com Sm22.6. A frequência de células TCD4+Foxp3+ foi maior no grupo de camundongos que receberam Sm22.6, Sm29 e PIII, sendo a freqüência de células TCD4+IL-10+ elevada apenas em camundongos imunizados com Sm22.6. Conclusão: Os antígenos do S. mansoni Sm22.6, PIII e Sm29 possuem a habilidade para modular os mediadores inflamatórios alérgicos in vitro por CMSP de indivíduos asmáticos e em modelo murino de asma. Estes antígenos podem representar futuras estratégias para prevenir doenças alérgicas.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-12T19:23:22Z No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Joanemile Figueiredo.pdf: 10179633 bytes, checksum: 58c4b5620c6ef7bea0cc319ebb0cccb3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-12T19:23:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_ICS_ Joanemile Figueiredo.pdf: 10179633 bytes, checksum: 58c4b5620c6ef7bea0cc319ebb0cccb3 (MD5) / esquistossomose é uma doença de grande impacto na saúde pública dos países em desenvolvimento. As principais ações de controle da transmissão da doença são através da educação, melhorias no saneamento e campanhas de tratamento em massa. O desenvolvimento de vacina representa uma importante estratégia para o controle da mesma, entretanto, ainda não foi desenvolvida vacina que confira proteção adequada contra a infecção humana. Por outro lado, há evidências que infecções crônicas parasitárias, especialmente pelo S. mansoni, protegem contra as alergias. Com o objetivo de esclarecer o papel da IgE e IgG4 na indução de resistência/susceptibilidade à infecção pelo Schistosoma mansoni e no risco de desenvolvimento de asma foi avaliado, em uma grande casuística, indivíduos de área endêmica em esquistossomose do interior da Bahia. Foi observado que a razão entre IgE/IgG4 para antígeno solúvel de verme adulto do S. mansoni (SWAP) foi maior nos indivíduos não infectados ou com baixas cargas, quando comparado aos indivíduos altamente infectados. A carga parasitária de S. mansoni foi positivamente correlacionada com os níveis de IgE total, de IgG4 específico para SWAP e para o antígeno solúvel do ovo do S. mansoni (SEA). Os valores dos anticorpos e a razão entre eles, não interferiram, entretanto, no risco de reinfecção seis meses após o tratamento da parasitose. Adicionalmente, os indivíduos não infectados pelo S. mansoni, apresentaram níveis mais elevados de IgE específico e da razão IgE/IgG4 para antígeno 1 do Dermatophagoides pteronyssinus (Der p1), quando comparado aos infectados, enquanto que não foi observado diferença significativa nos níveis de IgG4 específico entre os dois grupos. Essas diferenças, no entanto, não foram observadas quando as análises foram ajustados para idade, gênero e grau de exposição à água contaminada. Estes resultados ressaltam o papel fundamental da IgG4 específica para antígenos do S. mansoni e da relação IgE/IgG4 na resistência/susceptibilidade à infecção por este helminto. Por outro lado, é possível que a infecção pelo S. mansoni proteja contra o desenvolvimento da asma, modulando negativamente a produção de anticorpos que participam da resposta inflamatória alérgica. O melhor entendimento do papel da resposta imune humoral na resistência à infecção pelo S. mansoni e no controle da asma pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de controle destas doenças. / Salvador

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4883_1.pdf: 533158 bytes, checksum: a8fe77f19b526c214de32f360524bb17 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Liposomas são vesículas formadas por fosfolipídios, adicionados ou não de colesterol e lipídios com carga, que encapsulam um compartimento aquoso. Os lipossomas podem carrear fármacos hidrofílicos e hidrofóbicos. Uma variedade de polissacarídeos de diversas origens têm a habilidade de potencializar o sistema imune, comportando-se como imunomoduladores e farmacologicamente são classificados como modificadores de resposta biológica (MRB). O objetivo do presente trabalho consistiu em encapsular a o derivado sulfatado de Ramalina celastri (&#945;-glucana-SO4) em lipossomas convencionais e avaliar a sua ação antihelmíntica em sua forma livre e encapsulada sobre a infecção experimental pelo Schistosoma mansoni. Os lipossomas foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico, cujos constituintes foram fosfatidilcolina de soja, colesterol e estearilamina (7:2:1) contendo &#945;-Glucana-SO4 (2 mg/ml). As formulações lipossomais foram submetidas a testes de estabilidade acelerada (centrifugação 3000 rpm durante 1h; estresse mecânico, 150 strokes, 48 h) e a longo prazo (ciclo gelo/degelo durante 16 h a - 18°C e 8 h a 25°C ± 1°C). As preparações foram observadas macro e microscopicamente antes e após cada teste. Nos ensaios in vivo , foram utilizados camundongos fêmeas, albino Swiss (25±2 g, idade 30-40 dias), divididos em 4 grupos: G1- tratados com &#945;- Glucana-SO4 livre, G2- controle NaCl 150mM, G3- tratados com &#945;-Glucana-SO4 encapsulada em lipossomas e G4- lipossomas vazios. Os animais foram tratados 24 horas após a infecção, sacrificados e perfundidos após 56 dias da infecção. Os parâmetros avaliados foram: excreção de ovos, número de vermes recuperados do sistema portahepático- mesentérico, número de granulomas hepáticos e intestinais além do padrão de marcação com lectinas nestes órgãos. Foi obtido uma taxa de encapsulação de 50% e observou-se um leve decaimento de pH (7,4 a 6,8) dos lipossomas em suspensão, ao longo de 180 dias. Os lipossomas obtidos apresentaram-se estáveis quanto aos testes de estabilidade acelerada e a longo prazo. As formulações lipossomais na forma liofilizada apresentaram-se estáveis após 60 dias. O grupo tratado com &#945;-Glucana-SO4 livre reduziu 90,1% na eliminação de ovos nas fezes e, em 80%, os vermes totais em relação ao grupo controle. Esses resultados foram estatisticamente iguais aos obtidos com a &#945;-Glucana-SO4 encapsulada. Em ambos os parâmetros (ovos excretados e vermes recuperados), o grupo lipossomas vazios apresentou efeito sobre a parasitose. Com relação ao número de granulomas hepáticos, os dois tratamentos foram eficazes reduzindo em 62% e 63%, respectivamente, em relação aos controles. Foram encontrados raros granulomas intestinais em todos os grupos, o que já era esperado pelo próprio perfil da parasitose. Quanto ao padrão de marcação com lectinas, a Con A marcou o sistema ovo-granuloma no grupo &#945;- Glucana-SO4 livre e encapsulada e não foi verificada esta marcação no grupo NaCl 150 mM e lipossomas vazios. Já a lectina WGA marcou o sistema ovo-granuloma em todos os grupos. Pelo exposto constata-se a atividade biológica da &#945;-Glucana-SO4 e que a encapsulação neste tipo de lipossoma e nestas condições experimentais causaram o mesmo efeito do polissacarídeo livre

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4925_1.pdf: 508056 bytes, checksum: 85e981daa9d6d714824f51e4073a3195 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / A esquistossomose mansônica apresenta ciclo de infecção, tratamento e reinfecção. A Forma clínica severa da doença promove danos teciduais que afetam órgãos vitais como o fígado e podem levar a alterações no metabolismo lipídico. Neste trabalho, foram avaliadas em Callithrix jacchus as alterações decorrentes de uma segunda infecção após 60 dias da primeira por infestação com 400 cercárias de Schistosoma mansoni. Os níveis de colesterol total, colesterol éster, fosfolipídio total e triglicerídeos foram determinados por método colorimétrico, enquanto o colesterol esterificado formado in vitro pela ação da lecitina: colesterol aciltransferase (LCAT) foi determinado utilizando substrato radioativo contendo [14C]colesterol. Os resultados mostraram redução significativa nos níveis de lipídeos neutros, colesterol total e triglicerídeos, bem como de fosfolipídio total em animais infectados, sendo esta redução significativamente mais acentuada em plasma de animais submetidos à segunda infecção. Similarmente a atividade da LCAT foi significativamente reduzida, após a primeira infecção ocorreu 25% de diminuição na atividade fracional da LCAT em comparação aos animais controles, sendo esta redução ainda maior após a reinfecção (39%). Os resultados indicam que a segunda infecção por S. mansoni promove alterações lipídicas plasmáticas mais acentuadas do que aquelas provenientes da primeira infecção

ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam o ATP e o ADP a AMP e Pi e estão envolvidos em inibição da agregação plaquetária. No parasita Schistosoma mansoni nosso grupo identificou e clonou o gene da ATPDase1, e a proteína foi localizada na superfície do tegumento. Recentemente, clonamos o gene da ATPDase2 usando a informação do banco de dados de ESTs de S. mansoni e imunolocalizamos a sua proteína também no tegumento. ATPDase2 foi encontrada em ambas as membranas do tegumento basal e apical juntamente com a ATPDase1, entretanto ATPDase2 somente foi encontrada no espaço sincicial do tegumento. A presença de ambas as enzimas sobre a superfície externa do tegumento sugere um maior papel sobre a regulação de abundância de nucleotídeos. Análise da expressão de ambos os genes foram realizadas por RT- PCR em tempo real usando RNA de ovos, miracídeo, cercária, esquistossômulo e verme adulto. Os resultados mostraram que o gene da ATPDase1 foi mais expresso em ovos (7 vezes), adulto (6 vezes), cercária (3,5 vezes) e esquistossômulo (1,5 vezes) quando comparado ao miracídio, que foi tomado como referência. O gene da ATPDase2 foi mais expresso em ovos (16 vezes), cercária (11 vezes), miracídio (7 vezes) e verme adulto (2 vezes) quando comparado a esquistossômulo, mostrando que ambos os genes são modulados ao longo de seus estágios de ciclo de vida . Para maior caracterização destas enzimas, elas foram expressas heterologamente na levedura Pichia pastoris como proteínas de fusão com cauda de 6 histidinas e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade com resina de Ni-NTA. As ATPDases recombinantes foram obtidas de forma ativa e medições de atividade enzimática foram realizadas. ATPDase1 - mostrou atividades ATPásica e ADPásica em torno de 650 e 160 nmoles Pi.min -1. mg-1 , respectivamente. ATPDase2 teve atividades ATPásica e ADPásica na faixa de 1050 e 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectivamente. Adicionalmente, atividades UTPásica e UDPásica também foram encontradas nestas enzimas. Estudos de dicroísmo circular com estas duas enzimas elucidaram suas estruturas secundárias. Com isto, ATPDase1 (S66 to Q507 ) teve alfa-hélice (7 %), folha-beta (45 %) e estrutura randômica (48 %), e a ATPDase2 (N83 a K564 ) mostrou conter alfa-hélice (14 %), folha-beta (33 %) e estrutura randômica (53 %). Nós mostramos que a ATPDase2 é secretada pelo parasita no meio, de forma similar como descrito para as ATP-difosfohidrolases humanas CD39L2 e CD39L4. Adicionalmente, em ensaios de inibição de penetração (cercária em camundongo) usando anticorpo anti- ATPDase1 foi mostrada uma redução em 20 % da capacidade de penetração através da pele das cercárias previamente incubadas com o anti-soro. Devido a que a expressão do gene da ATPDase2 estava mais alta em miracídio e cercária, estágios que infectam caramujos e humanos, respectivamente, postulamos que ATPDase2 poderia ajudar no processo de invasão do parasita. No estágio ovo ambos os genes estão altamente expressados sugerindo um possível envolvimento das ATPDases na resposta de proteção contra o sistema imune humano. Ensaios de proteção contra S. mansoni em camundongos, usando as ATPDases 1 e 2 como antígenos, resultaram em uma baixa proteção obtendo-se não mais que 20% na redução da carga parasitária. / ATPDases or ATP-diphosphohydrolases are enzymes that cleave ATP and ADP to AMP and Pi and are involved in inhibition of platelet aggregation. In the parasite Schistosoma mansoni our group had identified and cloned the ATPDase1 gene and localized the protein on the tegument surface. Recently, we cloned the ATPDase2 gene using S. mansoni EST databank information and we immunolocalized it also in the tegument. ATPDase 2 was found on both the apical and basal tegument membranes together with ATPDase1, but only ATPDse2 was found in the syncytium space of the tegument. The presence of both enzymes on the tegumental outer surface suggests a major role in regulation of nucleotides abundance. Expression analysis of both genes was performed by Real Time RT- PCR using RNA from eggs, miracidia, cercariae, schistosomula and adult worms. The results showed that ATPDase1 gene was more expressed in eggs (7-fold), adults (6-fold), cercariae (3.5-fold) and schistosomula (1.5-fold) when compared to miracidia, which was taken as the reference. ATPDase2 gene was more expressed in eggs (16-fold), cercariae (11-fold), miracidia (7-fold) and adult worms (2-fold) when compared to schistosomula, showing that both genes are modulated along the life cycle stages. For further characterization of these enzymes, they were expressed heterologously in the yeast Pichia pastoris as fusion proteins with hexa-histidine tags and the recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant ATPDases were obtained in active form and activity measurements were performed. ATPDase1 did show ATPase and ADPase activities about 650 and 160 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. ATPDase2 had ATPase and ADPase activities in the range of 1050 and 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. These results were obtained in the presence of calcium as cofactor. Additionally, UTPase and UDPase activities were found for both enzymes. Circular dichroism studies with these enzymes elucidated their secondary structures; ATPDase1 (S66 to Q507 ) has alpha helix (7%), beta sheet (45%) and random coil (48%), whereas ATPDase2 (N83 a K564 ) showed alpha helix (14%), beta sheet (33%) and random coil (53%). We found that ATPDase2 was secreted by the parasite to the medium, similar to what has been described for human CD39-L2 and CD39-L4 ATP-diphosphohydrolases. Additionally, a penetration assay (cercaria to mice) using antibody anti-ATPDase1 did show a decrease of 20% in the penetration capacity through mice skin of cercaria previously incubated with this antiserum. Because ATPDase2 gene expression was increased in miracidia and cercariae, the stages that infect snail and human, respectively, we postulate that ATPDase2 may help the parasite\'s invasion process. In the egg stage both genes were highly expressed suggesting a possible involvement of the ATPDases in the protection response of eggs against the human immune system. Assays of protection against S. mansoni in mice, using recombinant ATPDase1 and 2 as antigens, resulted in low protection obtaining no more than 20% of parasite burden reduction.

Schistosoma mansoni é o parasita causador da esquistossomose mansônica que, de acordo com o Ministério da Saúde do Brasil, afeta atualmente vários milhões de pessoas no país. Uma das formas de diagnóstico da esquistossomose é a detecção de ovos do parasita através da análise de lâminas microscópicas com material fecal. Esta tarefa é extremamente cansativa, principalmente nos casos de baixa endemicidade, pois a quantidade de ovos é muito pequena. Nesses casos, uma abordagem computacional para auxílio na detecção de ovos facilitaria o trabalho de diagnóstico. Os ovos têm formato ovalado, possuem uma membrana translúcida, apresentam uma espícula e sua cor é ligeiramente amarelada. Porém nem todas essas características são observadas em todos os ovos e algumas delas são visíveis apenas com uma ampliação adequada. Além disso, o aspecto visual do material fecal varia muito de indivíduo para indivíduo em termos de cor e presença de diversos artefatos (tais como partículas que não são desintegradas pelo sistema digestivo), tornando difícil a tarefa de detecção dos ovos. Neste trabalho investigamos, em particular, o problema de detecção das linhas que contornam a borda de vários dos ovos. Propomos um método composto por duas fases. A primeira fase consiste na detecção de estruturas do tipo linha usando operadores morfológicos. A detecção de linhas é dividida em três etapas principais: (i) realce de linhas, (ii) detecção de linhas, e (iii) refinamento do resultado para eliminar segmentos de linhas que não são de interesse. O resultado dessa fase é um conjunto de segmentos de linhas. A segunda fase consiste na detecção de subconjuntos de segmentos de linha dispostos em formato elíptico, usando um algoritmo baseado na transformada Hough. As elipses detectadas são fortes candidatas a contorno de ovos de S. mansoni. Resultados experimentais mostram que a abordagem proposta pode ser útil para compor um sistema de auxílio à detecção dos ovos. / Schistosoma mansoni is one of the parasites which causes schistosomiasis. According to the Brazilian Ministry of Health, several million people in the country are currently affected by schistosomiasis. One way of diagnosing it is by egg identification in stool. This task is extremely time-consuming and tiring, especially in cases of low endemicity, when only few eggs are present. In such cases, a computational approach to help the detection of eggs would greatly facilitate the diagnostic task. Schistosome eggs present oval shape, have a translucent membrane and a spike, and their color is slightly yellowish. However, not all these features are observed in every egg and some of them are visible only with an adequate microscopic magnification. Furthermore, the visual aspect of the fecal material varies widely from person to person in terms of color and presence of different artifacts (such as particles which are not disintegrated by the digestive system), making it difficult to detect the eggs. In this work we investigate the problem of detecting lines which delimit the contour of the eggs. We propose a method comprising two steps. The first phase consists in detecting line-like structures using morphological operators. This line detection phase is divided into three steps: (i) line enhancement, (ii) line detection, and (iii) result refinement in order to eliminate line segments that are not of interest. The output of this phase is a set of line segments. The second phase consists in detecting subsets of line segments arranged in an elliptical shape, using an algorithm based on the Hough transform. Detected ellipses are strong candidates to contour of S. mansoni eggs. Experimental results show that the proposed approach has potential to be effectively used as a component in a computer system to help egg detection.

ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam o ATP e o ADP a AMP e Pi e estão envolvidos em inibição da agregação plaquetária. No parasita Schistosoma mansoni nosso grupo identificou e clonou o gene da ATPDase1, e a proteína foi localizada na superfície do tegumento. Recentemente, clonamos o gene da ATPDase2 usando a informação do banco de dados de ESTs de S. mansoni e imunolocalizamos a sua proteína também no tegumento. ATPDase2 foi encontrada em ambas as membranas do tegumento basal e apical juntamente com a ATPDase1, entretanto ATPDase2 somente foi encontrada no espaço sincicial do tegumento. A presença de ambas as enzimas sobre a superfície externa do tegumento sugere um maior papel sobre a regulação de abundância de nucleotídeos. Análise da expressão de ambos os genes foram realizadas por RT- PCR em tempo real usando RNA de ovos, miracídeo, cercária, esquistossômulo e verme adulto. Os resultados mostraram que o gene da ATPDase1 foi mais expresso em ovos (7 vezes), adulto (6 vezes), cercária (3,5 vezes) e esquistossômulo (1,5 vezes) quando comparado ao miracídio, que foi tomado como referência. O gene da ATPDase2 foi mais expresso em ovos (16 vezes), cercária (11 vezes), miracídio (7 vezes) e verme adulto (2 vezes) quando comparado a esquistossômulo, mostrando que ambos os genes são modulados ao longo de seus estágios de ciclo de vida . Para maior caracterização destas enzimas, elas foram expressas heterologamente na levedura Pichia pastoris como proteínas de fusão com cauda de 6 histidinas e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade com resina de Ni-NTA. As ATPDases recombinantes foram obtidas de forma ativa e medições de atividade enzimática foram realizadas. ATPDase1 - mostrou atividades ATPásica e ADPásica em torno de 650 e 160 nmoles Pi.min -1. mg-1 , respectivamente. ATPDase2 teve atividades ATPásica e ADPásica na faixa de 1050 e 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectivamente. Adicionalmente, atividades UTPásica e UDPásica também foram encontradas nestas enzimas. Estudos de dicroísmo circular com estas duas enzimas elucidaram suas estruturas secundárias. Com isto, ATPDase1 (S66 to Q507 ) teve alfa-hélice (7 %), folha-beta (45 %) e estrutura randômica (48 %), e a ATPDase2 (N83 a K564 ) mostrou conter alfa-hélice (14 %), folha-beta (33 %) e estrutura randômica (53 %). Nós mostramos que a ATPDase2 é secretada pelo parasita no meio, de forma similar como descrito para as ATP-difosfohidrolases humanas CD39L2 e CD39L4. Adicionalmente, em ensaios de inibição de penetração (cercária em camundongo) usando anticorpo anti- ATPDase1 foi mostrada uma redução em 20 % da capacidade de penetração através da pele das cercárias previamente incubadas com o anti-soro. Devido a que a expressão do gene da ATPDase2 estava mais alta em miracídio e cercária, estágios que infectam caramujos e humanos, respectivamente, postulamos que ATPDase2 poderia ajudar no processo de invasão do parasita. No estágio ovo ambos os genes estão altamente expressados sugerindo um possível envolvimento das ATPDases na resposta de proteção contra o sistema imune humano. Ensaios de proteção contra S. mansoni em camundongos, usando as ATPDases 1 e 2 como antígenos, resultaram em uma baixa proteção obtendo-se não mais que 20% na redução da carga parasitária. / ATPDases or ATP-diphosphohydrolases are enzymes that cleave ATP and ADP to AMP and Pi and are involved in inhibition of platelet aggregation. In the parasite Schistosoma mansoni our group had identified and cloned the ATPDase1 gene and localized the protein on the tegument surface. Recently, we cloned the ATPDase2 gene using S. mansoni EST databank information and we immunolocalized it also in the tegument. ATPDase 2 was found on both the apical and basal tegument membranes together with ATPDase1, but only ATPDse2 was found in the syncytium space of the tegument. The presence of both enzymes on the tegumental outer surface suggests a major role in regulation of nucleotides abundance. Expression analysis of both genes was performed by Real Time RT- PCR using RNA from eggs, miracidia, cercariae, schistosomula and adult worms. The results showed that ATPDase1 gene was more expressed in eggs (7-fold), adults (6-fold), cercariae (3.5-fold) and schistosomula (1.5-fold) when compared to miracidia, which was taken as the reference. ATPDase2 gene was more expressed in eggs (16-fold), cercariae (11-fold), miracidia (7-fold) and adult worms (2-fold) when compared to schistosomula, showing that both genes are modulated along the life cycle stages. For further characterization of these enzymes, they were expressed heterologously in the yeast Pichia pastoris as fusion proteins with hexa-histidine tags and the recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography. The recombinant ATPDases were obtained in active form and activity measurements were performed. ATPDase1 did show ATPase and ADPase activities about 650 and 160 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. ATPDase2 had ATPase and ADPase activities in the range of 1050 and 250 nmoles Pi.min-1.mg-1 , respectively. These results were obtained in the presence of calcium as cofactor. Additionally, UTPase and UDPase activities were found for both enzymes. Circular dichroism studies with these enzymes elucidated their secondary structures; ATPDase1 (S66 to Q507 ) has alpha helix (7%), beta sheet (45%) and random coil (48%), whereas ATPDase2 (N83 a K564 ) showed alpha helix (14%), beta sheet (33%) and random coil (53%). We found that ATPDase2 was secreted by the parasite to the medium, similar to what has been described for human CD39-L2 and CD39-L4 ATP-diphosphohydrolases. Additionally, a penetration assay (cercaria to mice) using antibody anti-ATPDase1 did show a decrease of 20% in the penetration capacity through mice skin of cercaria previously incubated with this antiserum. Because ATPDase2 gene expression was increased in miracidia and cercariae, the stages that infect snail and human, respectively, we postulate that ATPDase2 may help the parasite\'s invasion process. In the egg stage both genes were highly expressed suggesting a possible involvement of the ATPDases in the protection response of eggs against the human immune system. Assays of protection against S. mansoni in mice, using recombinant ATPDase1 and 2 as antigens, resulted in low protection obtaining no more than 20% of parasite burden reduction.

Schistosoma mansoni é o parasita causador da esquistossomose mansônica que, de acordo com o Ministério da Saúde do Brasil, afeta atualmente vários milhões de pessoas no país. Uma das formas de diagnóstico da esquistossomose é a detecção de ovos do parasita através da análise de lâminas microscópicas com material fecal. Esta tarefa é extremamente cansativa, principalmente nos casos de baixa endemicidade, pois a quantidade de ovos é muito pequena. Nesses casos, uma abordagem computacional para auxílio na detecção de ovos facilitaria o trabalho de diagnóstico. Os ovos têm formato ovalado, possuem uma membrana translúcida, apresentam uma espícula e sua cor é ligeiramente amarelada. Porém nem todas essas características são observadas em todos os ovos e algumas delas são visíveis apenas com uma ampliação adequada. Além disso, o aspecto visual do material fecal varia muito de indivíduo para indivíduo em termos de cor e presença de diversos artefatos (tais como partículas que não são desintegradas pelo sistema digestivo), tornando difícil a tarefa de detecção dos ovos. Neste trabalho investigamos, em particular, o problema de detecção das linhas que contornam a borda de vários dos ovos. Propomos um método composto por duas fases. A primeira fase consiste na detecção de estruturas do tipo linha usando operadores morfológicos. A detecção de linhas é dividida em três etapas principais: (i) realce de linhas, (ii) detecção de linhas, e (iii) refinamento do resultado para eliminar segmentos de linhas que não são de interesse. O resultado dessa fase é um conjunto de segmentos de linhas. A segunda fase consiste na detecção de subconjuntos de segmentos de linha dispostos em formato elíptico, usando um algoritmo baseado na transformada Hough. As elipses detectadas são fortes candidatas a contorno de ovos de S. mansoni. Resultados experimentais mostram que a abordagem proposta pode ser útil para compor um sistema de auxílio à detecção dos ovos. / Schistosoma mansoni is one of the parasites which causes schistosomiasis. According to the Brazilian Ministry of Health, several million people in the country are currently affected by schistosomiasis. One way of diagnosing it is by egg identification in stool. This task is extremely time-consuming and tiring, especially in cases of low endemicity, when only few eggs are present. In such cases, a computational approach to help the detection of eggs would greatly facilitate the diagnostic task. Schistosome eggs present oval shape, have a translucent membrane and a spike, and their color is slightly yellowish. However, not all these features are observed in every egg and some of them are visible only with an adequate microscopic magnification. Furthermore, the visual aspect of the fecal material varies widely from person to person in terms of color and presence of different artifacts (such as particles which are not disintegrated by the digestive system), making it difficult to detect the eggs. In this work we investigate the problem of detecting lines which delimit the contour of the eggs. We propose a method comprising two steps. The first phase consists in detecting line-like structures using morphological operators. This line detection phase is divided into three steps: (i) line enhancement, (ii) line detection, and (iii) result refinement in order to eliminate line segments that are not of interest. The output of this phase is a set of line segments. The second phase consists in detecting subsets of line segments arranged in an elliptical shape, using an algorithm based on the Hough transform. Detected ellipses are strong candidates to contour of S. mansoni eggs. Experimental results show that the proposed approach has potential to be effectively used as a component in a computer system to help egg detection.

Seconde affection parasitaire dans le monde derrière la malaria, la bilharziose ou schistosomiase demeure une maladie infectieuse tropicale négligée. L'espèce Schistosoma mansoni est la principale responsable de la forme digestive de la bilharziose humaine pouvant évoluer vers une pathologie chronique grave chez 5 à 10 % des individus infectés. Plusieurs années après l’infection, une fibrose hépatique importante se développe dans le foie et la paroi de l’intestin. La fibrose peut entraîner une hypertension portale et des varices gastro-oesophagiennes dont la rupture est potentiellement létale. Cette complication hépatosplénique est souvent associée à une hépatomégalie et une splénomégalie. L’objectif de ce travail était de fournir la première caractérisation longitudinale par IRM in vivo du modèle murin de schistosomiase digestive obtenu par infection de souris CBA/J avec Schistosoma mansoni. Le second objectif était la mise au point d’une technique quantitative ou semi-quantitative permettant d’évaluer la fibrose hépatique dans ce modèle. Nos données d’imagerie anatomique avec et sans agent de contraste (Gd-DOTA) et de relaxométrie (cartographies par mesure des temps de relaxation T2 et T2*) ont permis de confirmer les points communs entre le modèle murin de schistosomiase et la maladie humaine en termes d’organomégalie, d’inflammation granulomateuse, de fibrose et d’atteinte du système porte. Nos résultats suggèrent que le paramètre T2 pourrait être un biomarqueur non invasif et semi-quantitatif de la fibrose hépatique bilharzienne qui pourrait être utile dans le diagnostic et le suivi de la complication hépatosplénique et dans l’évaluation de nouvelles thérapies. / The second parasitic disease in the world behind malaria, bilharzia or schistosomiasis remains a neglected tropical infectious disease. Schistosoma mansoni is the main cause of the digestive form of human schistosomiasis that can progress to a severe chronic pathology in 5 to 10% of infected individuals. Several years after infection, significant hepatic fibrosis develops around parasite eggs in the liver and intestinal wall. Fibrosis can lead to portal hypertension and gastroesophageal varices, the rupture of which is potentially lethal. This hepato-splenic complication of digestive schistosomiasis is often associated with hepatomegaly and splenomegaly. The standard technique for the diagnosis of liver fibrosis is biopsy. The classical non-invasive evaluation of liver fibrosis is done by ultrasound imaging using an international classification scale (Niamey scale). Echography allows the assessment of portal hypertension by measuring the diameter of the portal vein and enables the detection of portal varices. The aim of this work was to provide the first in vivo longitudinal MRI characterization of the murine model of digestive schistosomiasis obtained by infection of CBA/J mice with Schistosoma mansoni. The second objective was to develop a quantitative or semi-quantitative method to evaluate liver fibrosis in this model. Our anatomical and volumetric data show that the murine model of schistosomiasis shares several features with the human disease such as organomegaly, granulomatous inflammation, and portal vein involvement. We propose that T2 mapping could help detect and follow-up semi-quantitatively fibrosis-related schistosomiasis.