La phospholipase D (PLD) hydrolyse les phospholipides membranaires en libérant leur tête polaire afin de générer l'acide phosphatidique (PA), impliqué dans la signalisation cellulaire. Pour comprendre les propriétés biochimiques des PLDs, les travaux présentés ont été réalisés autour de deux axes. Le premier axe concerne l'expression recombinante et la purification de la PLDa d'Arabidopsis thaliana (AtPLDa) dans la levure Pichia pastoris. La détermination de la séquence N-terminale a révélé que l'AtPLDa est amputée de ses 35 premiers résidus, suggérant ainsi la participation d'un mécanisme de maturation. Cependant, la région N-terminale des PLDs de plantes est homologue au domaine C2, impliqué dans leur interaction Ca2+-dépendante avec la membrane. Afin d'évaluer l'impact d'un tel clivage, les domaines C2 de l'AtPLDa mais également de l'AtPLDß, à titre de comparaison, ont été étudiés sous leur forme entière ou mature. Ainsi, la caractérisation de leur affinité pour les phospholipides, associée à leur modélisation tridimensionnelle, ont permis de démontrer que les différences de régulation par le Ca2+, observées entre les formes entières et mature, provenait de la présence d'une hélice a amphipathique, retirée lors du processus de maturation. Le second axe concerne le développement d'une nouvelle méthode de mesure des activités PLD via le dosage de manière direct, spécifique et continu du PA grâce à la propriété d'amplification de fluorescence par chélation de la 8-hydroxyquinoléine, en présence de Ca2+. Ainsi, ce test apparait adapté pour le suivi de l'inhibition des PLDs et pour l'étude de leur spécificité de substrat, en utilisant des phospholipides naturels avec différentes tête polaires, et à l'échelle d'une microplaque / Phospholipase D (PLD) hydrolyses membrane phospholipids, leading to the formation of free polar headgroup and phosphatidic acid releasing, involved in cell signaling. To understand the biochemical properties of PLDs, this work has been made around two axes. The one first concerns the recombinant expression and purification of the PLDa of Arabidopsis thaliana (AtPLDa) in the yeast Pichia pastoris. The N-terminal sequence of the recombinant AtPLDa has been determined and found to lack its first 35 amino acids, suggesting the involvement of a maturing mechanism. However, plant PLDs exhibit a C2-lipid binding domain at their N-terminal region, which is involved in their Ca2+-dependent membrane targeting. Thus, to assess the impact of such a cleavage, whole and mature-like C2 domains of AtPLDa, as well as of AtPLDß, for the sake of comparison were studied. Thus, the characterization of their affinity for phospholipids, combined with their three-dimensional modeling have demonstrated that the differences observed in their regulation by Ca2+, observed between whole and mature-like forms, originated from the presence of a N-terminus amphipathic a helix, removed during the maturation process. The second axis concerns the development of a novel PLD assay that measure PA in a direct, specific and continuous manner, using the chelation enhanced fluorescence property of 8-hydroxyquinoline in the presence of Ca2+. Thus, this assay appears suitable for monitoring both the inhibition of PLDs as well as their substrate specificity, using natural phospholipids with different polar headgroups, and at a microplate scale
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2016LYSE1292 |
| Date | 14 December 2016 |
| Creators | Rahier-Corticchiato, Renaud |
| Contributors | Lyon, Abousalham, Abdelkarim, Noiriel, Alexandre |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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