O interesse na obtenção de novos fármacos a partir de micro-organismos endofíticos vem crescendo, uma vez que esta é uma fonte ainda pouco explorada. Além disso, o estudo das interações entre plantas e micro-organismos tem sido amplamente discutido ao longo dos últimos anos. No presente trabalho, o fungo endofítico Drechslera ravenelii (SS33), isolado das folhas de Smallanthus sonchifolius (yacon), foi cultivado sob diferentes condições fermentativas, objetivando a determinação das melhores condições para produzir metabólitos secundários com atividades antimicrobiana e/ou citotóxica. Para tal avaliaram-se dois parâmetros: meio fermentativo e tempo de incubação. Os meios fermentativos líquidos utilizados foram Czapek e caldo de batata (PDB), sob agitação (120 RPM), cultivados por 216 e 480 horas. Também foi desenvolvida cultura por fermentação em substrato sólido, meio de arroz-aveia, durante 720 horas. Todos os cultivos foram realizados em temperatura de 30 ºC e precedidos por pré-fermentação. Dos cultivos em meio líquido foram obtidas frações em diclorometano e em acetato de etila. Já dos cultivos provenientes do meio fermentativo sólido foram obtidas frações em n-hexano, diclorometano, acetato de etila e n-butanol. Dessa forma, obtiveram-se 12 frações que foram concentradas em rotaevaporador até a secura, pesadas e identificadas. As frações tiveram sua atividade antimicrobiana avaliada através de duas técnicas: técnica da bioautografia e técnica da microdiluição em microplaca (determinação da Concentração Inibitória Mínima), utilizando-se como indicadores biológicos as cepas Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa. A avaliação da atividade citotóxica foi realizada pela técnica do MTT, utilizando-se três linhagens de células tumorais MB435 (melanoma humano), HCT-8 (cólon humano) e SF-295 (glioblastoma humano). As frações tiveram também seus perfis químicos avaliados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Após observação dos resultados obtidos, concluiu-se que a fração diclorometânica, proveniente do meio fermentativo sólido, foi a que apresentou maior rendimento, manejo mais simples e perfil cromatográfico mais interessante, quando comparada às outras frações obtidas dos meios sólido e líquido. Desse modo, foi realizada ampliação da escala fermentativa em meio sólido e a fração diclorometânica obtida foi submetida a processos cromatográficos visando o isolamento das substâncias majoritárias. Assim, foram isoladas a substância 1 (não identificada) e a substância 2, identificada como terpestacina, um sesterpeno incomum com conhecida atividade na inibição da formação de sincícios pelo vírus HIV. A terpestacina foi isolada pela primeira vez do fungo Drechslera ravenelii no presente estudo. A substância 2 não apresentou atividade antimicrobiana quando submetida ao ensaio da microdiluição em microplaca e apresentou atividade citotóxica discreta, frente a três linhagens de células cancerígenas humanas. / The interest in obtaining new drugs from endophytic microorganisms is growing, since this is a source still little exploited. In addition, the study of the interactions between plants and microorganisms has been widely discussed over the past few years. In this work, the endophytic fungus Drechslera ravenelii (SS33), isolated from the leaves of Smallanthus sonchifolius (yacon), was grown under different conditions, targeting the determination of the best conditions to produce secondary metabolites with antimicrobial and/or cytotoxic activities. For that, two parameters were evaluated: culture medium type and incubation time. The liquid media used were Czapek and Potato Dextrose Broth (PDB), swirling (120 RPM), cultivated for 216 and 480 hours, respectively. The fungus has also been culture by fermentation in solid substrate, rice-oats medium, during 720 hours. All crops were conducted in temperature of 30 °C and preceded by pre-fermentation. The obtained liquid mediums were submitted to liquid partition to furnish dichloromethane and ethyl acetate fractions. The solid medium was submitted to extraction to furnish the fractions in n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate and n-butanol, in sequence. |Then, the 12 fractions obtained were dried, cumbersome and identified. The antimicrobial activity of the fractions was evaluated through two techniques: bioautography and Microdiluition method (Minimum Inhibitory Concentration-MIC), and for that, the biological indicators used were Kocuria rhizophila, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. The cytotoxic activity evaluation was performed by MTT test, using three tumor cell lines: MB435 (human melanoma), HCT-8 (human colon) and SF-295 (human glioblastoma). The chromatographic profiles of the fractions were evaluated by High Performance Liquid Chromatography. Analysis of the results allowed to conclude that the dichloromethane fraction from the solid medium gave greater yield, was easier to manager and more displayed an interesting chromatographic profile when compared to other fractions obtained from both solid and liquid media. Thus, the fungus was cultivated in a larger scale in solid medium and the dichloromethane fraction obtained was subjected to chromatographic processes aiming the isolation of the major compounds. Thus, two compounds were isolated the substance 1 (unidentified) and the substance 2, witch was identified as terpestacin, an uncommon sesterpene, which inhibits the formation of syncytia in the course of HIV infection. The terpestacin was isolated for the first time from the fungus Drechslera ravenelii in this study. The compound 2 did not presented antimicrobial activity when subjected to the microdilution test and it displayed discreet cytotoxic activity in three human cancer cell lines.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-08062010-161118 |
| Date | 08 June 2010 |
| Creators | Eliane de Oliveira Silva |
| Contributors | Jairo Kenupp Bastos, Giuliano Cesar Clososki, Luis Henrique Souza Guimarães |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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